北京市懷柔區(qū)第一醫(yī)院（101400）王偉

隨著人口的老齡化和我國民眾飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）的發(fā)病率也呈持續(xù)上升趨勢。由于2型糖尿病發(fā)病率遠高于1型，患者年齡偏大，多合并高血壓及心腦血管性疾患，故對人類的危害更大。糖尿病腎病（diabeticnephropathy，DN）是DM最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。DN病理表現(xiàn)為腎小球硬化，發(fā)病早期表現(xiàn)為腎小球濾過率降低和正常白蛋白尿，繼而由于基底膜增厚導(dǎo)致微量白蛋白尿，后期出現(xiàn)持續(xù)的蛋白尿、水腫、高血壓等腎病表現(xiàn)。KKAy小鼠是自發(fā)2型糖尿病的動物模型[1]。其發(fā)病是在遺傳易感的基礎(chǔ)上加環(huán)境因素而誘發(fā)與人類2型糖尿病表現(xiàn)極為相似。本研究引進該動物模型，觀察其作為2型糖尿病致腎臟病模型的價值，探討其發(fā)病機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 6～8周雄性KKAy小鼠8只和KK小鼠11只，采用普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 實驗方法和取材 隨機血糖大于13.9mmol/L者診斷為糖尿病。實驗結(jié)束時取血測血糖等指標(biāo)后，以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速分離腎臟，留標(biāo)本于4%中性甲醛，右腎置于液氮。

1.3 腎臟組織PAS染色 部分腎臟組織于4%中性甲醛中固定24h以上，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，切片3μm厚，經(jīng)PAS染色。

1.4 腎臟組織免疫組化染色 常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水，3% H202甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶，孵育20min后，以1∶100 VEGF抗體（一抗，北京中杉公司）4℃過夜孵育，陰性對照只加PBS液，辣根酶標(biāo)記鏈親和素（二抗，北京中杉公司）室溫孵育60min后，以DAB法顯色。結(jié)果以IPP5.1圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，比較腎小球平均光密度（腎小球著色面積IOD/腎小球總面積）。

1.5 實時熒光定量PCR檢測腎皮質(zhì)VEGF基因表達 用Trizol試劑（Invitrogen，美國）一步法提取大鼠腎臟總RNA，電泳判定RNA的質(zhì)量。使用ReverTra Ace-α cDNA試劑盒（TOYOBO，日本）合成大鼠腎臟cDNA。體系20μL，5×RT buffer 4μL，dNTPs 2μL，Random Primer 1μL，ReverTra Ace 1μL，RNase inhibitor 1μL，RNA 3μL，RNase free H2O 8μL。反應(yīng)條件：30℃ 10min，42℃ 20min，99℃5min，4℃ 5min。合成的cDNA于-80℃凍存。用ABI?PRISM 7300（美國 ABI Biosystem）實時熒光定量PCR儀進行基因檢測。SYBR? Green PCR Master Mix購自TOYOBO（日本）。體系50μL，SYBR?Green Real time PCR Master Mix 25μL，蒸餾水18μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA 5μL。反應(yīng)條件：95℃ 60s，1循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 45s，40循環(huán)。內(nèi)參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。引物均由上海生工生物公司合成。VEGF上游引物序列5’-TTACTGCTGTACCTCCAC-3’，下游引物序列5’- ACAGGACGGCTTGAAGATA-3’[2]；GAPDH上游引物序列5’-CATGCCAA CGCCCTCTTCGA-3’，下游引物序列5’-TGTCCCCGTTCTCATCCTGCAC-3’。使用2-ΔΔCT方法計算基因表達情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件處理實驗數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的以（±s）表示，偏態(tài)分布的變量數(shù)據(jù)以中位數(shù)（范圍）表示，并經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換使之正態(tài)化后采用t檢驗及方差分析進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組腎皮質(zhì)病理改變比較 實驗結(jié)束時KA組小鼠的血糖（19.75士3.98）mmol/L明顯高于KB組（8.14士3.15）mmol/L（P＜0.01）。PAS染色后光鏡下可見KA組有腎小球硬化表現(xiàn)，即ECM明顯增多，腎小球系膜區(qū)增寬、HE染色陽性物質(zhì)增多，基底膜增厚，見附圖1。

2.2 腎小球VEGF的免疫組化比較 KA組小鼠腎小球系膜區(qū)、臟層上皮細(xì)胞、壁層上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多處腎小血管壁均出現(xiàn)了VEGF陽性著色，KB組個別也有VEGF陽性著色，但明顯輕于前者。圖像分析顯示KA組和KB組腎小球VEGF平均光密度分別為0.03和0.01（P＜0.01），見附圖2。

2.3 腎臟組織VEGF的real-time PCR比較KA組糖尿病小鼠腎臟VEGF mRNA表達明顯高于KB對照組17%（P＜0.01）。

3 討論

糖尿病腎病的主要病理變化是腎小球基底膜（GBM）和以腎小球系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積累，導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化。從本實驗的病理檢查可見，KA組小鼠腎小球體積增大，PAS紅染區(qū)明顯擴大，腎小球毛細(xì)血管袢略顯僵硬，系膜基質(zhì)增生，提示已經(jīng)出現(xiàn)早期腎臟形態(tài)學(xué)改變，尤其是腎臟微血管損傷。糖尿病腎病的發(fā)病機制目前尚未完全闡明，研究認(rèn)為有多方面因素參與，國內(nèi)余葉蓉等研究顯示[3]，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，大血管內(nèi)皮依賴性血管舒張功能是受損的。VEGF是目前所知作用最強的一種促血管生成因子，具有高度特異性地促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的作用[4]。高血糖、組織低氧、氧化應(yīng)激及多種細(xì)胞因子可刺激組織細(xì)胞產(chǎn)生VEGF。VEGF過度表達可通過改變內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等作用，從而改變細(xì)胞外基質(zhì)分泌，增加毛細(xì)血管通透性，促進新生血管形成。它可以通過增加腎臟微血管的通透性和單核細(xì)胞的滲出參與腎損害的發(fā)生。有研究表明，糖尿病大鼠腎臟肌酐清除率、蛋白尿增加，可能與腎組織VEGF表達增加相關(guān)[5][6]。通過免疫組化和實時定量PCR方法也證實了KKay小鼠VEGF在腎臟的表達明顯增加。腎小球增高的VEGF在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中作用復(fù)雜，不排除高血糖、糖基化終末產(chǎn)物、氧自由基等物質(zhì)對毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成一定損害，內(nèi)皮細(xì)胞分泌一些細(xì)胞分子，其中包括VEGF，加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，造成血管通透性增強，蛋白漏出，形成蛋白尿，漏出的蛋白又刺激細(xì)胞外基質(zhì)增生加重腎小球硬化，參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

附圖1 兩組大鼠腎臟組織病理變化（PAS×400）

附圖2 兩組大鼠腎臟VEGF蛋白表達（×200）

綜上所述，VEGF作為DN的發(fā)生發(fā)展過程以及療效觀察的實驗室指標(biāo)有著一定意義及臨床價值，對于監(jiān)測早期DN的發(fā)生和病情發(fā)展程度有重要意義。