陳亞波，周 敏，楊 彤

(中山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測所廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站(中山)，廣東中山 528403)

維生素B12又稱鈷胺素或氰鈷素，是由含鈷的卟啉類化合物組成的B 族維生素，深紅色針狀晶體，結(jié)構(gòu)性質(zhì)穩(wěn)定。在中性溶液中耐熱，而酸、堿、日光、氧化劑和還原劑均能使其破壞。目前，維生素B12有多種檢測方法，包括微生物檢測法［1-4］、高效液相色譜法［5-7］、原子吸收分光光度法［8］、化學(xué)發(fā)光分析法［9］、酶聯(lián)免疫法［8］、液相色譜-質(zhì)譜儀法［10］等。對于維生素飲料等功能性飲料，國家標(biāo)準(zhǔn)是采用高效液相色譜法，但由于儀器靈敏度不夠、干擾較大等原因，高效液相色譜法的應(yīng)用受到很大的限制。微生物法則由于其高靈敏度及可靠性已得到國際上權(quán)威機(jī)構(gòu)的廣泛認(rèn)可。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

生化培養(yǎng)箱 (上海一恒);高壓滅菌器(Hirayama，日本);密封培養(yǎng)罐(北京路橋);pH計(jì)(奧立龍，美國);離心機(jī)(HETTICH，德國);紫外可見分光光度計(jì)(VARIAN，美國);旋渦混合器(IAK，德國)。

萊士曼氏乳酸桿菌(ATCC 7830，美國);維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心);MRS肉湯(北京路橋);哥倫比亞CNA 瓊脂(北京路橋);無菌脫纖維羊血(北京路橋);CO2產(chǎn)氣袋(三菱瓦斯，日本);乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基(BD，美國);乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基(BD，美國);維生素B12測定用培養(yǎng)基(BD，美國)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.2.1 維生素B12貯備液(10 μg·mL-1)

精確稱取維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用25%乙醇定容至1 000 mL，儲存于冰箱內(nèi)，保存期3個(gè)月。

1.2.2 維生素B12中間液(100 ng·mL-1)

用25%乙醇溶液將20 mL 維生素B12貯備液定容至200 mL，儲存于冰箱內(nèi)，保存期3個(gè)月。

1.2.3 維生素B12工作液(1 ng·mL-1)

用25%乙醇溶液將2.0 mL 維生素B12中間液定容至200 mL，儲存于冰箱內(nèi)，保存期3個(gè)月。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液

分別吸取5 mL 維生素B12工作液于250 和500 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，濃度分別為0.02，0.01 ng·mL-1，臨用前配制。

1.3 測試菌液的制備

1.3.1 萊士曼氏乳酸桿菌凍干菌株的活化

無菌條件下，將凍干菌株開封后，接種于MRS 肉湯中，35℃，正常環(huán)境培養(yǎng)48 h，然后接入含羊血的哥倫比亞CNA 培養(yǎng)基中，35℃下5%CO2環(huán)境培養(yǎng)48 h。

1.3.2 測試菌液制備

將活化后的萊士曼氏乳酸桿菌接種到乳酸桿菌瓊脂斜面上，(36 ±1)℃培養(yǎng)24 h，再轉(zhuǎn)接2～3代以增強(qiáng)活力。轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，(36 ±1)℃培養(yǎng)18～24 h 后，2 000 r·min-1離心3 min，棄上清液，加入10 mL 0.9%生理鹽水，混勻，再離心。如前操作，再清洗2 次，制成菌懸液。吸取適量該菌懸液于10 mL 0.9%生理鹽水中，混勻制成測試菌液。用紫外可見分光光度計(jì)，以0.9%生理鹽水做空白，在550 nm 波長下測定測試菌液的透光率，調(diào)節(jié)加入菌懸液的量，使測試菌液的透光率60%～80%。

1.4 樣品前處理

稱取1.3 g 無水磷酸氫二鈉，1.0 g 無水偏重亞硫酸鈉，1.2 g 檸檬酸(含1個(gè)結(jié)晶水)，用100 mL蒸餾水溶解。取適量樣品于三角瓶中，用10 mL 上述溶液混合，加150 mL 蒸餾水，用鋁箔紙封口，121℃水解10 min，冷卻后調(diào)pH 值至4.5±0.2，再用蒸餾水定容至250 mL，過濾。移取濾液5 mL，加入20～30 mL 蒸餾水，調(diào)pH 值至6.8 ±0.2，用蒸餾水定容至100 mL，為樣品處理液，備用。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

按表1 順序依次加入蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和維生素B12測定用培養(yǎng)基于試管中，1 式3 份，反應(yīng)體系均為10 mL。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.6 待測液的制備

依次加蒸餾水、樣品處理液和維生素B12測定用培養(yǎng)基于試管內(nèi)，1 式3 份，反應(yīng)體系為10 mL(表2)。

表2 待測液的制備

1.7 滅菌及接種培養(yǎng)

將所有試管蓋上試管帽于121℃滅菌5 min。滅菌完畢，將試管取出后在冷水浴中迅速冷卻至30℃以下。用移液器向上述試管中各加50 μL 測試菌液，混勻，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管中S1除外。S1不接種菌液為不接種空白，S2接種菌液為接種空白。將所有試管放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)，(36 ±1)℃培養(yǎng)19～20 h。

1.8 測定方法

培養(yǎng)結(jié)束后，未接種空白試管S1內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)澄清，標(biāo)準(zhǔn)曲線管和試樣管中培養(yǎng)液的濁度應(yīng)有梯度。以接種空白管S2作對照，在550 nm 波長下測定最高濃度管S10的吸光度，每隔2 h 進(jìn)行測定。若2 次結(jié)果吸光度差值小于2 %，則取出全部試管測定吸光度。用未接種空白管S1作空白，調(diào)紫外可見分光光度計(jì)吸光度到0，讀出接種空白管S2的讀數(shù)。再以接種空白管S2為空白，調(diào)節(jié)吸光度為0，讀出其他每支試管的吸光度。

測定時(shí)，每支試管用渦旋混合器充分混合后，立即將培養(yǎng)液移入比色皿，讀出吸光度。以維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得該待測液中維生素B12的濃度，再根據(jù)稀釋因子和樣品量計(jì)算出試樣中維生素B12的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)維生素B12標(biāo)準(zhǔn)系列管的吸光度平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。維生素B12含量在0.01～0.10 ng范圍線性關(guān)系良好。線性回歸方程為y=5.993 2x-0.056 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6。因此，可據(jù)此計(jì)算出樣品中維生素B12的含量。

2.2 方法的精密度

將3種不同品牌的維生素飲料各自取平行樣2份，測定維生素B12含量，按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法要求，計(jì)算精密度(表3)，精密度均小于10 %，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 方法的重復(fù)性

對同一維生素飲料樣品按照本法進(jìn)行10 次測定，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)(表4)。10 次測定的平均值為1.399 μg·L-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.738 0%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%，測定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，方法重復(fù)性好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 方法的準(zhǔn)確度

對3種飲料進(jìn)行回收率試驗(yàn)(表5)。取已知維生素B12含量的樣品，再加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品處理方法，進(jìn)行一系列的操作?；厥章示_(dá)到96.5%以上，方法準(zhǔn)確度高。

表5 試樣加標(biāo)回收試驗(yàn)

3 小結(jié)

本試驗(yàn)采用微生物法測定維生素飲料中維生素B12含量，方法靈敏度高，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，方法精密度高，值得經(jīng)常進(jìn)行維生素檢測的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用推廣。但是，微生物法在很多方面依然不易掌握，在檢測過程中應(yīng)謹(jǐn)慎對待，保證每一步操作符合要求，具體注意以下幾個(gè)方面。

準(zhǔn)備玻璃儀器時(shí)，使用活性劑對玻璃試管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗，清洗之后200℃干熱2 h，以除去微量生長因子、洗滌劑殘留及某些微生物產(chǎn)生的維生素等。

菌種的復(fù)蘇與活化一定要按照該菌種的要求嚴(yán)格進(jìn)行，否則測定中菌種會生長不好，且一定要注意無菌操作避免污染。

試管滅菌時(shí)應(yīng)留有適當(dāng)?shù)拈g隙，以保證滅菌過程條件一致，滅菌結(jié)束應(yīng)迅速取出冷卻，避免有色物質(zhì)產(chǎn)生。

取樣前，應(yīng)根據(jù)其標(biāo)示值估算取樣量，以保證樣品稀釋后的維生素濃度盡量被標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度所覆蓋。

每次試驗(yàn)過程各種條件應(yīng)盡量保持一致，以保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的代表性和有效性、試驗(yàn)的重復(fù)性及符合精密度要求。

［1］GB 5413.14—2010 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定［S］.

［2］張玉杰，呂為群，殷曉紅.奶基嬰幼兒食品中維生素B12活性測定:微生物分析法［J］.生物技術(shù)，1993 (8):39-43.

［3］張麗宏，王克新，王淼，等.微生物法測定乳粉中維生素B12的應(yīng)用和探討［J］.中國乳品工業(yè)，2008，10 (215):58-60.

［4］高星，許國慶.微生物法分別測定配方奶粉中的維生素B5及B12［J］.中國乳業(yè)，2003 (6):31-33.

［5］GB/T 5009.217—2008 保健食品中維生素B12的測定［S］.

［6］周迅雷，褚慶環(huán)，張志國，等.高效液相檢測嬰兒配方乳粉中的維生素B12［J］.食品工業(yè)科技，2009 (6):330-332，335.

［7］李紅艷，王瑾，邵亮亮，等.固相萃取高效液相色譜法測定功能性飲料中微量維生素B12［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012 (3):384-386.

［8］楊祖英.食品安全檢測手冊［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

［9］Fumio Watanabe，Shigeo Takenaka.Comparison of a microbiological assay and a fully automated chemiluminescent system for the determination fo vitamin B12in food ［J］.Agric Food Chemistry，1998，46 (6):1433-1436.

［10］徐雙陽，許榮年，汪慶旗，等.超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定嬰幼兒配方奶粉中的維生素B12［J］.食品工業(yè)，2011 (8):103-106.