喬 媛 方建國 肖 娟 劉 濤 劉 靜 王 楠 陳素華

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院 1婦產(chǎn)科，2藥學(xué)部，武漢 430030 3泰安市中心醫(yī)院，山東泰安 271000

·實驗研究·

黃芩素抗人巨細胞病毒的體外實驗研究*

喬 媛1方建國2肖 娟1劉 濤3劉 靜1王 楠1陳素華1

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2藥學(xué)部，武漢 4300303泰安市中心醫(yī)院，山東泰安 271000

目的體外研究黃芩素抗人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)的效果和安全性。方法細胞病變法和噻唑藍(MTT)法檢測各濃度黃芩素對人胚肺成纖維細胞(HEL)存活率及HCMV抑制率的影響，并與更昔洛韋進行比較。數(shù)據(jù)輸入SigmaPlot軟件，經(jīng)Hill方程曲線擬合計算藥物的半數(shù)毒性濃度(TC50)和半數(shù)有效濃度(EC50)。結(jié)果更昔洛韋和黃芩素的TC50分別為353.1g/ml和151.4g/ml，EC50分別為62.98g/ml和14.47g/ml，治療指數(shù)分別為6和10。結(jié)論黃芩素具有體外抗HCMV作用，值得進一步研究。

黃芩素； 人巨細胞病毒

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV) 屬于皰疹病毒β亞科，是引起先天性感染的最常見病毒。 據(jù)報道[1-2]，孕婦HCMV原發(fā)性感染率1％～7％，其宮內(nèi)傳播率30％～40％，宮內(nèi)感染可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)、胎兒畸形、智力發(fā)育落后等遠期后遺癥。目前，疫苗研究尚不成熟，更昔洛韋具有良好的抗HCMV作用，但由于其胚胎毒性、致突變性等問題，屬于妊娠期C類用藥[3]。因此，急需研究可在妊娠期使用的抗HCMV藥物。中國傳統(tǒng)中藥黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效，其主要有效成分黃芩素具有抗菌、抗病毒、抗感染、抗氧化、抗腫瘤及清除自由基等多種藥理作用[4]。為此，本文首次通過體外實驗，研究黃芩素抗 HCMV的效果及安全性，并與更昔洛韋進行比較，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞 HCMV AD169毒株由湖北省病毒研究所提供，人胚肺成纖維細胞株(human embryo lung fibroblast，HEL)由本院婦產(chǎn)科圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)實驗室保存。 細胞和病毒按常規(guī)方法在圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)實驗室培養(yǎng)傳代，并測定病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50％ tissue culture infective dose，TCID50)。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖型培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)，使用前加入10％ 小牛血清為細胞培養(yǎng)液，加入3％ 小牛血清為細胞維持液；細胞消化液為0.25％ 胰蛋白酶。噻唑藍(MTT，美國Sigma公司)用 0.01 mol/L PBS液 (pH=7.4 ) 溶解至濃度為5 mg/ml，0.22m微孔濾器過濾除菌，分裝，4 ℃ 避光保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)有效。

1.1.3 藥物 ①研究藥黃芩素由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院藥學(xué)部提供，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，-20 ℃凍存?zhèn)溆?；使用前用細胞維持液稀釋至10 mg/ml，其中DMSO 終濃度不超過0.1％；②對照藥更昔洛韋 (ganciclovir，GCV) 注射用滅菌粉劑(商品名麗科偉，湖北科益藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格0.25 g/amp，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20030419，生產(chǎn)批號：100532)，用細胞維持液配制成10 mg/ml的母液。以上各藥品均用0.22m孔徑微孔濾器過濾除菌，分裝，4 ℃保存，臨用前用細胞維持液稀釋至所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 病毒毒力測定 取生長良好的HEL經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化后，用細胞培養(yǎng)液調(diào)細胞數(shù)為2×105個/ml，加至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.1 ml，置37 ℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，待細胞長成單層后，吸棄各孔培養(yǎng)液，將HCMV按2倍梯度稀釋8個濃度，每個濃度接種4孔，每孔100l；另設(shè)正常細胞對照4孔，培養(yǎng)7 d，每日觀察記錄細胞病變(cytopathic effect，CPE)，CPE判定標(biāo)準(zhǔn)如下：(-)示細胞無病變，(+)示25％細胞出現(xiàn)病變，(++)示25％～50％細胞出現(xiàn)病變，(+++)示50％～75％細胞出現(xiàn)病變，(++++)示75％～100％細胞出現(xiàn)病變。應(yīng)用Reed-Muench法計算半數(shù)組織細胞感染量(50％ tissue culture infective dose，TCID50)。Reed-Muench法計算公式：TCID50=10a。其中，a= lgTCID50=高于50％細胞病變率病毒稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差；距離比例=(高于50％細胞病變率的百分數(shù)-50)/(高于50％細胞病變率的百分數(shù)-低于50％細胞病變率的百分數(shù))。

1.2.2 黃芩素細胞毒性測定 將HEL接種至96孔板，待細胞長成單層后，吸棄各孔培養(yǎng)液，將各藥物自母液開始按10倍梯度用細胞維持液稀釋8個濃度，使其終濃度為10.00 mg/ml、5.00 mg/ml、2.50 mg/ml、1.00 mg/ml、0.50 mg/ml、0.25 mg/ml、125.00g/ml和62.50g/ml，每個濃度設(shè)5孔，每孔100l，另設(shè)4孔正常細胞對照。置37 ℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，采用細胞病變(CPE)法和噻唑藍 (MTT)法兩種方法研究藥物的細胞毒性：①細胞病變(cytopathic effect，CPE)法：按常規(guī)于倒置顯微鏡下，每日觀察并記錄細胞生長情況及形態(tài)變化，確定各藥物對HEL的最大無毒濃度(0％ toxic dose，TD0)。判定標(biāo)準(zhǔn)如下：加藥后出現(xiàn)細胞皺縮、細胞間隙變大、胞質(zhì)粗糙、不透明、細胞內(nèi)有較多顆粒等形態(tài)改變記錄為(+)，示細胞出現(xiàn)藥物毒性反應(yīng)；細胞形態(tài)正常記錄為(-)，示細胞無藥物毒性反應(yīng)；未出現(xiàn)細胞形態(tài)改變的最大藥物濃度即為黃芩素對HEL的TD0。②MTT法：加入藥物后，置37 ℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，取出以PBS液沖洗細胞3遍，每孔加入MTT溶液20l，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100l，溶解紫藍色結(jié)晶，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。選擇492 nm波長，用96孔酶標(biāo)測定儀讀取各孔吸光度OD值，計算細胞存活率=(藥物處理組OD值/正常組對照孔OD值)×100％，經(jīng)Hill方程曲線擬合計算藥物的半數(shù)毒性濃度(50％ toxic concentrations，TC50)。

1.2.3 黃芩素抗HCMV效果測定 細胞接種96孔板，待細胞長成單層后，用100 TCID50的病毒攻擊量接種細胞，37 ℃，5％ CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，棄上清后，將各藥物自TD0開始按2倍梯度稀釋7個濃度，每個濃度設(shè)5孔，另設(shè)正常細胞對照和病毒對照組各5孔，培養(yǎng)7～10 d，采用MTT法研究藥物對HCMV致細胞病變的抑制作用：MTT法染色及測定OD值同上，根據(jù)OD值計算病毒抑制率。病毒抑制率=[(藥物處理組平均OD值-病毒對照組平均OD值)/正常對照組OD值]×100％，經(jīng)Hill方程曲線擬合計算藥物的半數(shù)有效濃度(50％ effective concentrations，EC50)。最后計算治療指數(shù)(TC50/EC50)。

以上實驗至少重復(fù)3次，取3次試驗結(jié)果的平均值作為試驗結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件處理所有的數(shù)據(jù)，濃度反應(yīng)曲線用Hill公式求TC50及EC50。

2 結(jié)果

2.1 HCMV 毒力

與正常HEL相比，HCMV 感染細胞變圓，腫脹，細胞間界限不清，培養(yǎng)液中可見多個脫落細胞。病毒感染性滴度測定結(jié)果，根據(jù)Reed-Muench公式計算，HCMV AD169毒株的TCID50為10-4.87。見圖1、表1。

A：正常HEL；B：HCMV感染HEL

表1 病毒感染性滴度測定結(jié)果

2.2 黃芩素細胞毒性

2.3 黃芩素對HCMV致細胞病變的抑制效果

MTT法檢測不同濃度的更昔洛韋、黃芩素對病毒抑制率的影響，經(jīng)Hill方程計算，兩者的EC50分別為62.98g/ml和14.47g/ml，h系數(shù)分別為0.791和1.017(見圖3)，即兩種藥物均具有病毒抑制作用，且具有劑量依賴性，藥物濃度越高，病毒抑制率越高。其中，黃芩素的病毒抑制作用相對較高。

圖2 黃芩素和更昔洛韋對HEL存活率的劑量-反應(yīng)曲線(Hill方程擬合)

圖3 黃芩素和更昔洛韋對HCMV抑制率的劑量-反應(yīng)曲線(Hill方程擬合)

2.4 治療指數(shù)(TC50/EC50)

更昔洛韋治療指數(shù)為353.1/62.98≈6，黃芩素治療指數(shù)為151.4/14.47≈10，黃芩素治療指數(shù)高于更昔洛韋。

上述結(jié)果提示，更昔洛韋和黃芩素在體外均具有抗HCMV作用，黃芩素的治療指數(shù)高于更昔洛韋。

3 討論

HCMV具有條件致病性，其感染率與地理位置、社會經(jīng)濟狀況、種族及文化程度等相關(guān)[5-7]。HCMV是發(fā)展中國家最常見的宮內(nèi)感染病原體，可經(jīng)血流通過胎盤垂直傳播給胎兒[8]，約10％宮內(nèi)感染兒出生后出現(xiàn)小頭畸形、低出生體重、肝脾腫大、血小板減少、高膽紅素血癥、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎等，約10％～15％出生時無癥狀的感染兒在出生后數(shù)年出現(xiàn)進行性感音神經(jīng)性耳聾、認知能力發(fā)育落后等異常[9]。

目前，尚無任何獲得批準(zhǔn)的疫苗用于預(yù)防HCMV宮內(nèi)感染，亦無任何獲得批準(zhǔn)的藥物用于治療妊娠期感染[10]。臨床廣泛使用更昔洛韋治療HCMV感染，如免疫缺陷病毒感染或器官移植術(shù)受體合并HCMV感染[11]，但更昔洛韋屬于妊娠期C類藥物[3]，具有一定的胚胎毒性，妊娠期使用受到限制。因此，臨床急需既具有抗HCMV作用、又可在妊娠期使用的藥物?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[12-14]發(fā)現(xiàn)，我國傳統(tǒng)中藥的許多有效成分，如生物堿(如黃連)、黃酮(如黃芩)、有機酸(如金銀花)、揮發(fā)油(如連翹)等，具有較強的抗病毒活性和增強機體免疫功能等作用，孕期常用藥物黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效，其主要有效成分黃芩素可體外阻斷表皮生長因子酪氨酸激酶活性、降低HCMV周期相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白表達、下調(diào)HCMV DNA水平。

為了系統(tǒng)研究黃芩素抗HCMV作用及妊娠期使用的安全性，本文以更昔洛韋為對照藥，應(yīng)用細胞病變法和MTT法，體外分析黃芩素的細胞毒性及抗HCMV的效果。結(jié)果顯示，與更昔洛韋類似，黃芩素在體外具有抗HCMV 作用，并具有劑量依賴效應(yīng)。綜合分析兩種藥物的細胞毒性和抗HCMV效應(yīng)，黃芩素的治療指數(shù)高于更昔洛韋的治療指數(shù)，具有一定的臨床應(yīng)用前景，值得進一步深入研究。

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AntiviralEffectsofBaicaleinonHumanCytomegalovirusinVitro

QIAO Yuan1，F(xiàn)ANG Jianguo2，XIAO Juan1，et al

1DepartmentofObestetricsandGynecology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofPharmaecutical,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

ObjectiveTo study the anti-cytomegalovirus effect and security of baicalein.MethodsHEL cell viability and HCMV inhibitory rate of baicalein in different dosage groups were detected with the cytopathic assay and MTT method，and ganciclovir was used as the control drug for comparison.All data input SigmaPlot statistical software for analyzing 50％ toxic concentrations(TC50)and 50％ effective concentrations (EC50).ResultsThe TC50of ganciclovir and baicalein were 353.1g/ml and 151.4g/ml；the EC50were 62.98g/ml and 14.47g/ml；TI were 6 and 10，respectively.ConclusionBaicalein has the potential advantages for clinical use and worth further study.

baicalein；human cytomegalovirus

10.3969/j.issn.1674-4616.2013.01.004

*國家自然科學(xué)基金資助項目(No：39970769，30371488，30672243)；

湖北省自然科學(xué)基金資助項目(No：2009CDD216)；

國家自然科學(xué)青年基金資助項目(No：81200354)

2013-01-11)