林 虎，渠晨曦，俞毅杰，湯逸寧，孫曉譯

(浙江大學城市學院醫(yī)學院，浙江 杭州 310015)

冬凌草甲素(Oridonin)，一種以貝殼杉烯為骨架的四環(huán)二萜類化合物，是冬凌草中主要的抗腫瘤活性成分。體內外研究表明冬凌草甲素對多種腫瘤如肝癌、食道癌、胃癌、大腸癌、白血病、肺腺癌、宮頸癌、黑色素瘤等有明顯的抑制作用［1-4］，是一個極有開發(fā)前景的天然藥物。但冬凌草甲素水溶解度低、油溶解性差、口服生物利用度低，大大限制了臨床應用［5］。靜脈用溶液劑“癌得寧”主要采用非水機溶劑(如丙二醇)和表面活性劑(如吐溫80)來提高溶解度［6］，長期靜脈注射會帶來血管發(fā)炎、疼痛等一系列安全問題，已逐步退出市場。

脂質體是一種具有類似生物膜結構的雙分子泡囊，主要由磷脂和膽固醇構成。它具有提高難溶性藥物溶解度、毒副作用小、易于靶向修飾等優(yōu)點，已作為一種先進的藥物傳遞系統(tǒng)，被越來越多的人認同，在各類納米制劑中最易實現(xiàn)產業(yè)化。長循環(huán)脂質體是指用親水高分子材料進行表面修飾的脂質體，特別是經聚乙二醇(PEG)修飾后可有效減少內皮網(wǎng)系統(tǒng)(RES)的吞噬，延長藥物體內循環(huán)時間，使脂質體透過腫瘤生長部位血管的幾率增大，從而增加藥物在腫瘤組織內的積聚［7］。

本研究擬利用乙醇注入法制備冬凌草甲素長循環(huán)脂質體，通過冷凍干燥技術得到凍干粉針，解決冬凌草甲素脂質體穩(wěn)定性差的問題［8］，并研究凍干脂質體大鼠體內藥動學特征，為冬凌草甲素長循環(huán)脂質體的研究和開發(fā)提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 冬凌草甲素(純度99%，西安昊軒生物科技有限公司);膽固醇(上海晶純試劑有限公司);大豆磷脂購自Lipoid 公司;二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPEPEG 2000，日本精細化工株式會社);Sephadex G-50、葡萄糖、甘露醇等均購自華東醫(yī)藥。

1.2 實驗動物 SD 雄性大鼠，體重(200±10)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號SCXK(滬)2012-0002。

1.3 冬凌草甲素長循環(huán)凍干脂質體的制備采用乙醇注入法制備脂質體［9］。將處方量的冬凌草甲素、卵磷脂、膽固醇、DSPE-PEG 2000溶于乙醇，一邊攪拌一邊滴加至含有凍干保護劑的生理鹽水中。探頭超聲(功率80 W，工作1 s，暫停1 s，重復30次，寧波新芝)，均化脂質體粒徑，過0.22μm 微孔濾膜。將上述長循環(huán)脂質體分裝至西林瓶中，于-40℃預凍8 h，于-40 ℃真空干燥5 h，-40 ℃～0 ℃干燥14 h，然后升溫至25 ℃共持續(xù)5 h 去除殘余水分(CHRIST Alpha 2-4 LSC 冷凍干燥儀，德國)。冬凌草甲素普通脂質體除不含DSPE-PEG 2000外，其余組成同上。

1.4 脂質體表征

1.4.1 粒徑測定 取凍干脂質體，以生理鹽水復溶，稀釋至合適濃度，激光衍射粒度分析儀(Nano ZS90，馬爾文，英國)測定粒徑及分布。

1.4.2 包封率測定 采用葡聚糖凝膠柱(1.5 cm×15 cm)分離脂質體和游離藥物，上樣量1 ml，洗脫液為生理鹽水。定時收集流出物，將脂質體部分用乙醇溶解后，HPLC 測定藥物濃度。色譜條件:Agilent 1260 液相色譜儀，色譜柱為Diamosil C18(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相:甲醇-水(70/30，v/v)，流速:1 ml/min，柱溫:30 ℃，進樣量:20μl。包封率EE(%)=脂質體內包裹的藥物量/投藥量。脂質體和游離藥物實現(xiàn)完全分離，藥物溶液和空白脂質體混合物的回收率為95.47%。滿足分析要求。

1.4.3 體外釋放 取凍干脂質體適量，以PBS復溶。如“1.4.2”項下純化脂質體，將載有總量為1 mg 冬凌草甲素的脂質體放入透析袋(MWCO:14 kDa)內。透析外相為50 ml 0.5%Tween 80 的PBS。37℃，100次/min 振搖條件下，間隔一定時間取樣0.5 ml，同時補加新鮮釋放液。樣品過0.45μm 微孔濾膜，“1.4.2”項下HPLC 法測定釋放液藥物濃度。

1.5 藥動學實驗

1.5.1 血漿樣本采集及處理 冬凌草甲素普通凍干脂質體及冬凌草甲素長循環(huán)凍干脂質體以適量生理鹽水復溶，備用。大鼠18 只，隨機分為3組，每組6 只，尾靜脈分別注射冬凌草甲素普通復溶脂質體、冬凌草甲素長循環(huán)復溶脂質體、冬凌草甲素溶液，劑量為10 mg·kg-1。于給藥后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h 尾靜脈取血，離心后取上層血漿按照“1.5.2”項下處理，計算血藥濃度。

1.5.2 體內分析方法 精確稱取冬凌草甲素25 mg 置25 ml 量瓶中，甲醇溶解定容，配成1.0 mg/ml 冬凌草甲素標準溶液。分別用空白血漿將上述標準液稀釋成0.25、0.5、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0μg/ml 系列標準液。參照文獻［10］，略有修改，進行血漿處理。取200μl 上述含藥血漿，向其中加入3 ml 乙酸乙酯-異丙醇溶液(19∶1)，混合提取5 min，離心10 min(5 000 r/min，4℃)，取上清2.5 ml，37℃氮氣揮干，100μl 甲醇復溶，取上清進行HPLC 分析，記錄色譜圖，以外標法進行定量。HPLC 色譜條件參考“1.4.2”，流動相比例為甲醇-水(50/50，V/V)。在0.25～40μg/ml 濃度范圍內得回歸方程A=12.645C+6.8278(r=0.9993)。濃度分別為0.2μg/ml、10μg/ml、40μg/ml 的血樣日內、日間精密度均小于7%;0.2μg/ml、10μg/ml、40μg/ml 樣品絕對回收率＞70%，符合體內分析要求。

1.6 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”表示，采用單因素方差分析，兩兩比較使用SNK檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藥脂比對包封率的影響 固定輔料用量:卵磷脂45 mg、膽固醇22 mg、DSPE-PEG 2000 80 mg，改變冬凌草甲素投藥量，使藥脂比(磷脂+膽固醇+DSPE-PEG 2000/冬凌草甲素質量)為1∶24、1∶12、1∶6、1∶3，結果見圖1。隨著脂質用量的增加，包封率顯著增加(P＜0.05)。當達到1∶12 時，包封率不再增加。

圖1 藥脂比對包封率的影響Fig.1 The effect of drug/lipid ratio on entrapment efficiency

2.2 磷脂/膽固醇比例對包封率的影響 固定DSPE-PEG 2000 用量80 mg、冬凌草甲素25 mg、磷脂與膽固醇總量67 mg，制備不同比例磷脂/膽固醇構成的長循環(huán)脂質體10 ml，再將其凍干。包封率結果如圖2 所示。隨著膽固醇用量的增加，長循環(huán)脂質體的包封率逐漸增加。當達到2∶1時，包封率達到最大值，與其余組有顯著性差異(P＜0.05)。繼續(xù)加大膽固醇用量，當比例為1∶1時包封率不再增加，反而有所下降，且粒徑有所增大(210 nm)。

圖2 磷脂與膽固醇比例對包封率的影響Fig.2 The effect of ratio of lecithin to cholesterol on entrapment efficiency

2.3 DSPE-PEG 2000 用量對包封率的影響固定處方中冬凌草甲素25 mg、卵磷脂45 mg、膽固醇22 mg 用量，分別添加20、40、80、100、120 mg DSPE-PEG 2000，制備凍干脂質體10 ml。由圖3 可見DSPE-PEG 2000 對包封率影響不大，無顯著差異(P＜0.05)，均在60%左右。

圖3 DSPE-PEG 2000 對包封率的影響Fig.3 The effect of DSPE-PEG 2000 on entrapment efficiency

2.4 凍干保護劑篩選 預實驗發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖、甘露醇做凍干保護劑效果優(yōu)于乳糖、右旋糖酐、蔗糖。復溶時間較短;復溶后粒徑變化較小、呈單峰分布;包封率高。但葡萄糖做保護劑時，產品有萎縮現(xiàn)象。甘露醇外形飽滿，但復溶時間偏長。凍干保護劑用量高于磷脂重量5 倍時，凍干品外觀飽滿。低于3 倍時，容易發(fā)生皺縮。綜上，我們合用葡萄糖和甘露醇，用量為磷脂質量的5 倍，對葡萄糖和甘露醇比例進行篩選(表1)。保護劑比例對包封率無顯著影響(P＜0.05)，隨著葡萄糖比例的增加，復溶脂質體粒徑變小，分布變窄。同時考慮價格因素，最后選用葡萄糖:甘露醇=3:1 作為凍干保護劑。得到的凍干品外觀良好，水化后，輕輕振搖，2 min 內可分散為均勻膠體溶液。

表1 凍干保護劑對冬凌草甲素長循環(huán)脂質體粒徑及包封率的影響Table 1 The effect of freeze-drying protectant on particle size and entrapment efficiency of long-circulation oridonin liposomes

2.5 體外釋放 體外釋放以冬凌草甲素溶液為對照，結果顯示兩種冬凌草甲素脂質體均有明顯的緩釋效果，緩釋時間達72 h。表面修飾對脂質體釋放速度影響不大，長循環(huán)凍干脂質體后期釋放稍快于普通脂質體(圖4)。

圖4 冬凌草甲素脂質體釋放曲線Fig.4 In vitro release of oridonin liposomes

2.6 藥動學實驗 根據(jù)HPLC 測定結果，繪制大鼠血藥濃度-時間曲線(圖5)，數(shù)據(jù)以Kinetica 軟件分析處理，結果見表2。長循環(huán)脂質體較溶液和普通脂質體有更長的t1/2α和t1/2β，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。MRT 與溶液和普通脂質體組有顯著性差異(P＜0.05)，分別為二者的6 倍和2 倍;AUC 也有大幅提高(P＜0.05)，分別為溶液組和普通脂質體的3 倍及2 倍。

表2 冬凌草甲素大鼠藥動學參數(shù)Table 2 Pharmacokinetic parameters of oridonin(，n=6)

表2 冬凌草甲素大鼠藥動學參數(shù)Table 2 Pharmacokinetic parameters of oridonin(，n=6)

圖5 大鼠尾靜脈注射冬凌草甲素溶液、普通脂質體和長循環(huán)脂質體后血藥濃度-時間曲線Fig.5 Mean plasma concentration-time curve in rats after intravenous dose of oridonin solution，oridonin liposomes and longcirculation oridonin liposo-mes

3 討論

冬凌草甲素長循環(huán)脂質體的制備目前主要采用薄膜分散法［11］，但存在載藥率不高(約1 mg/ml)、工藝放大較為困難等問題。本研究采用的乙醇注入法簡單易行，重復性好，得到的脂質體載藥量可提高至1.5 mg/ml。利用冷凍干燥技術，我們制備了凍干脂質體，與文獻［8］相比，有效解決了長循環(huán)脂質體存放過程中的物理及化學穩(wěn)定性方面的問題。

為優(yōu)化處方，我們進行了單因素實驗。脂質體通過磷脂雙分子層實現(xiàn)對冬凌草甲素的包載，隨著處方中磷脂比例的增加，包封率和載藥能力增大［12］。但當藥脂比從1:6 增加到1:12時，脂質體包封率只略有增加。為獲得較好的載藥量，盡可能減少脂質用量，我們選擇藥脂比1:6 制備冬凌草甲素長循環(huán)凍干脂質體。膽固醇對脂質體的包封率也有較大影響，作為膜流動性調節(jié)劑，可增加脂質雙分子層通透性，降低藥物滲漏，用量過大，則可造成脂質膜剛性偏大，不利于藥物的包載［13］。當卵磷脂和膽固醇的比例為2:1 時，制備的脂質體包封率最大，粒徑較小。DSPE-PEG 2000 是目前公認且最為常用的長循環(huán)修飾分子，其高分子親水長鏈可保護脂質體避免單核-巨噬系統(tǒng)的吞噬，延長體內循環(huán)時間。脂質體表面PEG 親水鏈密度對長循環(huán)作用的發(fā)揮極為重要作用，可保證脂質體有效通過EPR 效應到達瘤體部位;但過高的DSPE-PEG 濃度又會妨礙腫瘤細胞對脂質體的攝取。另一方面，PEG 長鏈還可減少脂質體間接觸、碰撞和聚集的機會，增加脂質體的物理穩(wěn)定性。在對包封率無顯著影響的前提下(圖3)，我們根據(jù)常用DSPE-PEG 2000 修飾濃度［14］，確定80 mg 的用量，用以制備長循環(huán)脂質體。凍干保護劑用量和種類對脂質體復溶粒徑、包封率、凍干品外觀都有顯著影響。經過篩選，我們最終確定優(yōu)化處方為大豆磷脂∶膽固醇∶DSPE-PEG 2000 為1∶0.5∶1.8(w/w)，藥脂比為1∶6(w/w)。凍干保護劑為葡萄糖∶甘露醇=3∶1，用量為脂質總量的5 倍。

根據(jù)以上處方制備的長循環(huán)凍干脂質體具緩釋效果，DSPE-PEG 修飾對其體外釋放行為無顯著影響。與普通脂質體相比，其后期稍快的釋放速度可能與PEG 長鏈有關。親水層減少了脂質體表面張力，使水分更容易接觸脂質體表面，從而加快了藥物釋放［15］。

采用HPLC 法測定血樣中冬凌草甲素濃度時，我們發(fā)現(xiàn)按照參考文獻［10］使用乙酸乙酯進行提取時，回收率較低。經過對提取溶劑的篩選，最終選用乙酸乙酯-異丙醇溶液(19∶1)，絕對回收率達70%，可滿足分析要求。

目前有關冬凌草甲素長循環(huán)脂質體藥動學的研究是給藥后在不同的時間點將小鼠處死，取血漿分析，存在動物用量大、個體差異大的問題。本研究通過尾靜脈采集單只大鼠完整時間點的血漿樣品，避免了上述問題［11］。體內藥代動力學研究結果表明，將冬凌草甲素制成普通脂質體和長循環(huán)脂質體后，改變了冬凌草甲素在大鼠體內的分布，各動力學參數(shù)發(fā)生明顯變化。與冬凌草甲素長循環(huán)固體脂質體納米粒藥動學結果相似［15］，3 種制劑均符合雙室模型特征［16］，MRT、AUC 等參數(shù)顯著增加，表明冬凌草甲素長循環(huán)凍干脂質體可有效延長藥物在血液中的存留時間，維持較高的血藥濃度，提示長循環(huán)凍干脂質體可以增加冬凌草甲素的抗腫瘤活性。

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