胡 琳，張華丹，陳亞天，華 男，曾玲暉

(浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310015)

癲癇(Epilepsy)是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，患者常表現(xiàn)為突然、短暫的運(yùn)動(dòng)、感覺、意識(shí)或精神等異常。反復(fù)的癇性發(fā)作嚴(yán)重影響患者生活和心理，甚至損害認(rèn)知功能。資料顯示，癲癇患者的生活質(zhì)量明顯低于正常人群，且低于其他慢性疾病患者，如高血壓、糖尿病等。迄今為止，癲癇的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，其治療主要依靠藥物和手術(shù)，而且抗癲癇藥物通常需長(zhǎng)期服用，且有明顯的副作用［1-3］。目前，與癲癇相關(guān)的發(fā)病機(jī)理及藥物治療研究仍主要依靠動(dòng)物模型。另外，由于癲癇的發(fā)作沒有預(yù)見性，發(fā)作程度也不能人為控制，從而給研究癲癇帶來困難。因此建立實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物癲癇模型，對(duì)于篩選、評(píng)價(jià)抗癲癇藥物的作用，具有重要意義。

匹羅卡品、紅藻氨酸和戊四氮是目前常用的幾種化學(xué)致癇藥物［4-7］。以往報(bào)道中模型動(dòng)物的選取基本以大鼠和近交系小鼠多見，采用ICR 小鼠的研究較少，而ICR 小鼠價(jià)格低廉。明確ICR 小鼠對(duì)常見化學(xué)致癇藥物的反應(yīng)性，在抗癲癇藥物篩選和毒理學(xué)研究等方面有良好的應(yīng)用前景。本研究在ICR 小鼠分別腹腔注射上述3 種藥物后，觀察癲癇急性發(fā)作情況，包括潛伏期、癲癇發(fā)作級(jí)別、以及死亡率等，并通過對(duì)比3 種模型中興奮性神經(jīng)元及苔蘚纖維發(fā)芽程度，探討ICR 品系小鼠對(duì)3 種藥物誘導(dǎo)的癲癇模型反應(yīng)性的差異。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及試劑年齡為6 周的雄性ICR 小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(滬)2012-0002)。動(dòng)物使用嚴(yán)格參照浙江大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)的規(guī)定執(zhí)行。匹羅卡品、紅藻氨酸、氫溴酸東莨菪堿和阿拉伯膠軍鉤子Sigma 公司，USA;地西泮購自江西制藥有限公司;其他試劑均為市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 按照隨機(jī)區(qū)組法將動(dòng)物按體重分成若干區(qū)組，再給每個(gè)區(qū)組中的動(dòng)物編號(hào)，利用隨機(jī)數(shù)表法分配到各組。由于預(yù)實(shí)驗(yàn)中各組死亡率不同，正式實(shí)驗(yàn)中采用分批的方式確?？捎糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物數(shù)一致。實(shí)驗(yàn)小鼠分為匹羅卡品組(pilocarpine，Pilo)、紅藻氨酸組(kainic acid，KA)、戊四氮組(pentylenetetrazol，PTZ)和 對(duì) 照組(control，Cont)。匹羅卡品組:ICR 小鼠先腹腔注射氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg，30 min 后再腹腔注射鹽酸匹羅卡品30 mg/kg。紅藻氨酸組:ICR 小鼠腹腔注射紅藻氨酸30 mg/kg。戊四氮組:ICR 小鼠腹腔注射戊四氮40 mg/kg，10 min 后20 mg/kg，之后每10 min 腹腔注射10 mg/kg，到出現(xiàn)Ⅳ-Ⅴ級(jí)癲癇發(fā)作。對(duì)照組:僅注射生理鹽水。所有動(dòng)物在一次SE 發(fā)作2 h 后，用安定(10 ml/kg)終止其發(fā)作。不同實(shí)驗(yàn)的樣本量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果從效應(yīng)強(qiáng)度和生物差異來確定。

癲癇的分級(jí)參照1972年Racine［8］制定的標(biāo)準(zhǔn):一級(jí):靜止不動(dòng)伴隨有嘴部/面部運(yùn)動(dòng);二級(jí):點(diǎn)頭及落水狗樣抖動(dòng);三級(jí):前肢陣攣;四級(jí):站立及雙側(cè)前肢陣攣;五級(jí):持續(xù)站立及跌倒;六級(jí):狂奔及尖叫。

1.3 Fluro-Jade B(FJB)染色 在SE 造模后7 d，根據(jù)發(fā)作級(jí)別和持續(xù)時(shí)間，各組選取小鼠8只腹腔注射10%的水合氯醛，待完全麻醉后，分別用PBS 和4%多聚甲醛(PFA)進(jìn)行心臟灌流。取出腦組織后，置于4%多聚甲醛內(nèi)固定過夜，再轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中置于4℃冰箱中至腦組織沉入底部。

FJB 染色參照我們以前發(fā)表的文獻(xiàn)［9］:切片用PBS 沖洗后，先用1%NaOH/80%酒精溶液浸泡5 min，然后依次在70%酒精和蒸餾水里各浸泡2 min。經(jīng)0.06%的高錳酸鉀溶液浸泡10 min(室溫，搖床)，切片稍經(jīng)水洗后，置于0.1%醋酸配置的0.001%FJB 溶液中浸染20 min(避光，搖床)。封片后結(jié)果在顯微鏡下觀察。

1.4 Timm 染色 在SE 造模后28 d，根據(jù)發(fā)作級(jí)別和持續(xù)時(shí)間，各組選取小鼠8 只腹腔注射10%的水合氯醛，待完全麻醉后，依次用生理鹽水、1%硫化鈉、生理鹽水、4%多聚甲醛(3 min)進(jìn)行心臟灌流固定。腦組織連續(xù)切片后，在含銀的緩沖液(10%阿拉伯膠60 ml，檸檬酸緩沖液10 ml，5.67%對(duì)二苯酚30 ml，2%硝酸銀2 ml)中避光孵育60～80 min，切片在蒸餾水洗10 min 后，脫水后封片，在顯微鏡下觀測(cè)齒狀回分子細(xì)胞層苔蘚纖維發(fā)芽狀況。

苔蘚纖維出芽評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Buckmaster文獻(xiàn)［10］:0 分:未見Timm 顆粒;1 分:偶見散在的片狀分布的Timm 顆粒;2 分:較多片狀分布的Timm 顆粒;3 分:Timm 顆粒接近連續(xù)分布;4分:濃密的Timm 顆粒帶，連續(xù)或接近連續(xù)分布;5 分:濃密、層帶狀Timm 顆粒連續(xù)分布。

1.5 錄像監(jiān)測(cè) 在SE 后第2天，將待觀察小鼠放入小鼠專用錄像籠中，每天持續(xù)記錄10 小時(shí)。觀看視頻，記錄小鼠每日發(fā)生自發(fā)性癲癇的次數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 除造模成功率外，其余數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，經(jīng)SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)。造模成功率的比較采用卡方檢驗(yàn)，癲癇發(fā)生潛伏期、癲癇發(fā)作次數(shù)及發(fā)生級(jí)別的比較采用one-way ANOVA 及S-N-K 分析，神經(jīng)細(xì)胞死亡及苔蘚纖維發(fā)芽采用one-way ANOVA 及Dunnetts 分析。P＜0.05 認(rèn)為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物誘導(dǎo)的急性癇性發(fā)作的表現(xiàn)在匹羅卡品、紅藻氨酸和戊四氮給藥后，分別觀察各組癲癇發(fā)生的癥狀、潛伏期、發(fā)作級(jí)別以及死亡率。注射紅藻氨酸后，小鼠逐漸出現(xiàn)凝視、點(diǎn)頭、面部及頭部抽搐、全身肌陣攣、跌倒，大、小便失禁及流涎，最終發(fā)生全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作、癲癇持續(xù)狀態(tài)，其癲癇發(fā)作狀態(tài)有逐漸由低級(jí)向高級(jí)發(fā)展的特點(diǎn)。如表1 所示，紅藻氨酸組小鼠潛伏期最長(zhǎng)，癲癇發(fā)作較穩(wěn)定，造模成功率在3組中最高。匹羅卡品組小鼠潛伏期較長(zhǎng)，癲癇發(fā)作等級(jí)較高，其死亡率相對(duì)于其他兩組高。注射匹羅卡品后，小鼠初期表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)不能、面部抽搐、單肢陣攣、濕狗樣抖動(dòng)、點(diǎn)頭和平衡失調(diào)等，之后很快出現(xiàn)肢體強(qiáng)直陣攣伴有站立及前肢陣攣等邊緣系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)性發(fā)作表現(xiàn)，最后大多數(shù)小鼠出現(xiàn)全身強(qiáng)直——陣攣發(fā)作伴有站立、跌倒，反復(fù)出現(xiàn)呈癲癇持續(xù)狀態(tài)。戊四氮組小鼠潛伏期極短，癲癇發(fā)作等級(jí)非常高，死亡率也較高。一般在注射戊四氮后的1min 內(nèi)，小鼠即出現(xiàn)軀體游走性痙攣、臀部上翹等表現(xiàn)，隨后出現(xiàn)瞼肌陣攣、凝視、點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)、尾巴上翹，繼之雙前肢抬起陣攣或后肢伸展、頭向左或右扭動(dòng)，隨后出現(xiàn)四肢抽搐;達(dá)到V 級(jí)以上發(fā)作的小鼠則表現(xiàn)為狂奔嘶叫、全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作，同時(shí)伴有全身青紫。在之后觀察的2 h 內(nèi)，小鼠仍然會(huì)間歇性出現(xiàn)大于等于4 級(jí)的癲癇發(fā)作。

表1 不同藥物誘發(fā)的小鼠急性癇性發(fā)作情況Table 1 Comparison of seizure latency，severity and success rate of modeling

2.2 不同藥物誘導(dǎo)的癲癇模型對(duì)神經(jīng)元死亡的影響 小鼠急性癇性發(fā)作后7 d，不同組別腦組織切片經(jīng)FJB 染色。如圖1 所示，對(duì)照組、匹羅卡品組、紅藻氨酸組和戊四氮組小鼠腦組織切片海馬CA1 區(qū)均未見到明顯的神經(jīng)元細(xì)胞死亡。同樣，對(duì)照組、匹羅卡品組、紅藻氨酸組和戊四氮組小鼠腦組織切片在海馬CA3 區(qū)、DG 區(qū)也均未見到明顯的神經(jīng)元細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未出示)。

圖1 不同藥物誘導(dǎo)的小鼠癲癇模型均未出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞死亡Fig.1 No cell death was detected in different drug-induced seizure model

2.3 不同藥物誘導(dǎo)的癲癇模型小鼠中苔蘚纖維發(fā)芽程度的不同 苔蘚纖維發(fā)芽是自發(fā)性癲癇的病理表現(xiàn)之一。為檢測(cè)ICR 小鼠不同藥物誘導(dǎo)的癲癇模型中苔蘚纖維發(fā)芽有無不同，在急性癇性發(fā)作后第28天小鼠灌流取腦行Timm 染色。如圖2 所示，匹羅卡品組(圖2B)和紅藻氨酸組(圖2C)可見明顯苔蘚纖維發(fā)芽，但戊四氮組(圖2D)與對(duì)照組相似，未見明顯苔蘚纖維發(fā)芽。對(duì)四組小鼠Timm 染色進(jìn)行評(píng)分的結(jié)果見表2，與對(duì)照組相比，匹羅卡品組和紅藻氨酸組均顯著增高(P＜0.001)。

圖2 不同藥物誘導(dǎo)的癲癇模型中苔蘚纖維發(fā)芽的差異Fig.2 Variability of mossy fiber sprouting in different drug-induced seizure model

表2 不同藥物誘導(dǎo)的癲癇小鼠模型中苔蘚纖維發(fā)芽評(píng)分情況Table 2 Timm's score in different drug-induced seizure model

2.4 不同藥物誘導(dǎo)的癲癇模型小鼠自發(fā)性癲癇的發(fā)作情況 在成功誘發(fā)急性癇性發(fā)作后次日，對(duì)小鼠每日采用錄像記錄，連續(xù)4 周，每組14 只。對(duì)照組小鼠和戊四氮組小鼠未觀察到自發(fā)性癲癇發(fā)作，匹羅卡品組小鼠有8 只發(fā)生自發(fā)性癲癇，發(fā)生率為57.1%;紅藻氨酸組小鼠有6 只發(fā)生自發(fā)性癲癇，發(fā)生率為42.9%。對(duì)小鼠逐周的癲癇發(fā)生次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移匹羅卡品和紅藻氨酸模型組癲癇的發(fā)作頻率均升高(圖3)。

圖3 自發(fā)性癲癇發(fā)生頻率隨時(shí)間的推移而增加Fig.3 The frequency of spontaneous seizure increased with time

3 討論

不同化學(xué)藥物誘導(dǎo)的癲癇模擬臨床不同的癲癇類型，匹羅卡品、紅藻氨酸和戊四氮是目前最常用的幾種癲癇模型的化學(xué)藥物［4-7］。既往的研究以SD 大鼠和C57BL6 小鼠為研究對(duì)象居多，然而SD 大鼠和C57BL6 價(jià)格是ICR 小鼠的4～6 倍。本研究系統(tǒng)觀察了ICR 小鼠對(duì)匹羅卡品、紅藻氨酸和戊四氮誘發(fā)的癲癇的行為學(xué)特征、神經(jīng)元丟失，苔蘚纖維出芽及自發(fā)性癲癇的發(fā)生狀況。結(jié)果顯示，ICR 小鼠對(duì)三種致癇藥物的反應(yīng)與SD 大鼠相似:匹羅卡品和紅藻氨酸單次注射即能誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)，在終止發(fā)作后一個(gè)月內(nèi)半數(shù)左右的動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)反復(fù)自發(fā)性發(fā)作，其表現(xiàn)類似于人類慢性顳葉癲癇;與匹羅卡品組相比，紅藻氨酸階段性明顯、行為學(xué)表現(xiàn)規(guī)律、穩(wěn)定、死亡率低。戊四唑閾下劑量反復(fù)注射，經(jīng)過多次刺激，半數(shù)以上的ICR 小鼠能夠成功點(diǎn)燃，但在其后的一個(gè)月內(nèi)未觀測(cè)到自發(fā)性癲癇發(fā)生，表現(xiàn)類似于人類急性失神性癲癇發(fā)作。因此，作為癲癇發(fā)病機(jī)制研究和藥物篩選，ICR 小鼠不失為一個(gè)既經(jīng)濟(jì)又有效的品系。

不同品系的小鼠對(duì)化學(xué)藥物誘導(dǎo)的癲癇呈現(xiàn)不同的反應(yīng)性［11-13］。比如紅藻氨酸誘發(fā)的癇性發(fā)作在C57BL6 品系的小鼠不易發(fā)生神經(jīng)元凋亡和苔蘚纖維出芽，而FBV 品系則容易出現(xiàn)細(xì)胞毒性。而在匹羅卡品誘發(fā)的急性癇性發(fā)作中，C57BL6 則出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元死亡和自發(fā)性癲癇發(fā)作。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)匹羅卡品和紅藻氨酸誘導(dǎo)急性癇性發(fā)作2 h 后，ICR 小鼠表現(xiàn)為明顯的苔蘚纖維發(fā)芽和自發(fā)性癲癇發(fā)生，但未見神經(jīng)元細(xì)胞死亡。不同品系的動(dòng)物對(duì)不同癲癇藥物反應(yīng)性的差異與動(dòng)物的遺傳特性以及不同致癇藥物的藥理作用及毒理作用機(jī)制高度相關(guān)。

神經(jīng)元死亡［14-15］和苔蘚纖維發(fā)芽［16-17］是癲癇持續(xù)狀態(tài)誘發(fā)的典型病理表現(xiàn)，從而導(dǎo)致神經(jīng)環(huán)路興奮性增高和自發(fā)性癲癇的發(fā)生。本研究中發(fā)現(xiàn)匹羅卡品和紅藻氨酸誘發(fā)急性癇性發(fā)作2 h 后，在ICR 小鼠能檢測(cè)到明顯苔蘚纖維發(fā)芽和自發(fā)性癲癇發(fā)作，但并沒有觀測(cè)到神經(jīng)元死亡，提示自發(fā)性癲癇發(fā)生可能與苔蘚纖維發(fā)芽直接相關(guān)，與以往相關(guān)報(bào)道一致［18］，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

由于樣本量大，本研究中對(duì)自發(fā)性癲癇的觀測(cè)采用每日錄像記錄10 h 的不連續(xù)方式，與連續(xù)腦電圖記錄相比，數(shù)據(jù)可能存在一定偏差。且僅觀測(cè)到造模后4 周，有的小鼠初始腦損傷的潛伏期長(zhǎng)，可能在4 周后才開始出現(xiàn)自發(fā)性癲癇發(fā)作，因此數(shù)據(jù)可能有遺漏。但從本研究結(jié)果仍然可看出，在匹羅卡品和紅藻氨酸誘發(fā)急性癇性發(fā)作后，半數(shù)左右的ICR 小鼠呈現(xiàn)自發(fā)性癲癇的發(fā)作，且發(fā)作頻率隨著時(shí)間的推移呈上升趨勢(shì)。

總之，本研究結(jié)果表明，ICR 小鼠在匹羅卡品、紅藻氨酸和戊四氮給藥后均顯示出與大鼠或C57BL6 小鼠相似的急性癇性發(fā)作。匹羅卡品和紅藻氨酸誘發(fā)ICR 小時(shí)2 小時(shí)的急性癲癇發(fā)作后未見明顯細(xì)胞死亡，但苔蘚纖維發(fā)芽明顯，可能與自發(fā)性癲癇的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。

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