朱 斌,袁岱岳,邵偉斌,嚴(yán)棟梁,郝清亞

(江蘇省南通市第一人民醫(yī)院肝膽外科,江蘇南通,226001)

骨橋蛋白(OPN)是一種具有多種生物活性的酸性非膠原糖蛋白,最早從骨基質(zhì)分離出來,具有鈣離子結(jié)合的特性[1]?，F(xiàn)已證明OPN在泌尿系結(jié)石的發(fā)生中起重要作用[2],但關(guān)于其與膽結(jié)石形成的關(guān)系的研究與報道較少。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測OPN在膽固醇結(jié)石患者和正常人的膽囊組織中的表達(dá)情況,探討OPN在膽囊膽固醇結(jié)石形成中的作用,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年7月—2012年10月本院普外科膽囊病理標(biāo)本共35例,并分為結(jié)石組和非結(jié)石組。結(jié)石組共納入單純膽囊膽固醇結(jié)石患者25例,男 6例 ,女 19例,年齡 24～83歲,平均(41±9.7)歲,術(shù)后以病理診斷及膽囊結(jié)石剖面結(jié)構(gòu)相結(jié)合作為診斷依據(jù)。非結(jié)石組納入因其他原因行膽囊切除的非膽囊結(jié)石患者的膽囊標(biāo)本10例,男8例,女2例,年齡41～77歲,平均(52±8.6)歲,其中肝癌5例,胰腺癌 2例,肝外傷1例,膽囊挫裂傷1例,胃癌1例,病理診斷為正常或接近正常膽囊,表現(xiàn)為膽囊黏膜腺體無增生、萎縮、壞死脫落,沒有纖維脂肪組織增生,有少量或無炎性細(xì)胞浸潤。

1.2 試劑與實(shí)驗(yàn)方法

鼠抗人OPN單克隆抗體(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)工作濃度為1∶100。采用Elivision二步法進(jìn)行染色。所用Elivison試劑盒(PV-9000)和DAB酶底物顯色(均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。具體步驟:石蠟組織行4 μ m厚度連續(xù)切片,經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后,其余操作按Elivison試劑盒說明書進(jìn)行。以陽性膽囊癌切片做陽性對照,PBS緩沖液代替一抗做陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

對OPN陽性表達(dá)的評估采用半定量積分法,綜合陽性細(xì)胞的百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行判斷。陽性細(xì)胞<5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分。染色強(qiáng)度無著色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。取陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度兩項(xiàng)積分評分,0分為(-),1～4分為(+),5～8分為(2+),9～12分為(3+)。所有標(biāo)本均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師以雙盲法閱片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)石組和對照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn),計(jì)算出P值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在OPN表達(dá)陽性的細(xì)胞內(nèi),見OPN集中表達(dá)于膽囊黏膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì)及管腔側(cè),在脫落的膽囊黏膜上皮細(xì)胞中也有表達(dá)。OPN在結(jié)石組中多呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)(圖1A),非結(jié)石組膽囊黏膜中呈弱陽性或陰性表達(dá)(圖2B)。經(jīng)半定量分析,2組有顯著差異(P<0.05),見表1。

圖1 OPN在膽囊黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況

表1 OPN在2組中的表達(dá)

3 討 論

OPN是一種非膠原性酸性骨基質(zhì)糖蛋白,其分子內(nèi)部含有包括一RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸),該序列通過與其受體avβ3整合蛋白結(jié)合參與鈣離子的代謝和組織的礦化,是促進(jìn)細(xì)胞黏附的蛋白質(zhì)中的特有結(jié)構(gòu)[3-5]。OPN在消化系統(tǒng)的許多臟器都有表達(dá),其中包括膽囊黏膜上皮及膽汁[1]。已證實(shí)OPN在泌尿系結(jié)石的形成和發(fā)展過程中有重要的作用,但是否有參與膽結(jié)石的形成,目前的研究報道較少。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化Elivision二步法,檢測OPN在單純膽囊膽固醇結(jié)石患者與非結(jié)石患者膽囊黏膜上皮內(nèi)的表達(dá)。與Ichikawa H等的報道相似[6],作者發(fā)現(xiàn)OPN集中表達(dá)于膽囊黏膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì)及管腔側(cè),在脫落的膽囊黏膜上皮細(xì)胞中也有表達(dá),單純膽囊膽固醇結(jié)石組患者OPN的表達(dá)要顯著高于非結(jié)石組?，F(xiàn)已證實(shí)在膽固醇結(jié)石中含有大量的鈣鹽沉積和OPN的表達(dá)[1,6]。有學(xué)者從膽固醇結(jié)石患者的膽汁中分離到OPN的功能區(qū)域—鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)RGD片段[6]。因此可以認(rèn)為OPN從膽囊黏膜上皮分泌,最終被包裹在膽固醇結(jié)石的中心,提示OPN可能在膽固醇結(jié)石的形成過程中有著重要的作用。

OPN在小鼠、大鼠及人腎臟均有表達(dá),主要位于亨利氏攀升枝和遠(yuǎn)曲小管,這些部位是與尿石形成有關(guān)礦物質(zhì)的高濃縮區(qū)[7]。草酸鈣晶體在腎小管上皮細(xì)胞腔面的黏附沉積對腎結(jié)石的形成起初始促進(jìn)作用[3]。Lieske等報道,OPN可通過其RGD序列與草酸鈣晶體結(jié)合,來影響草酸鈣晶體與腎小管上皮細(xì)胞結(jié)合[8-9]。國內(nèi)王瑩[10]用乙二醇誘導(dǎo)建立SD大鼠腎結(jié)石模型,發(fā)現(xiàn)從誘導(dǎo)第10天起腎結(jié)石組大鼠的OPN在遠(yuǎn)曲小管的表達(dá)要顯著高于對照組。此結(jié)果與本研究OPN在單純膽囊膽固醇結(jié)石患者中表達(dá)結(jié)果相類似,因此作者設(shè)想OPN是否也通過類似影響泌尿系結(jié)石形成的機(jī)制影響膽結(jié)石的形成。

本研究提示OPN參與了膽固醇結(jié)石的形成,可能會為今后治療膽囊結(jié)石的診斷和治療提供一個新的靶點(diǎn),但其具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究解決。

[1]Imano M,Satou T,Itoh T,et al.An immunohistochemical study of osteopontin in pigment gallstone formation[J].Am Surg,2010,76(1):91.

[2]Vernon H J,Osborne C,Tzortzaki E G,et al.Aprt/Opn double knockout mice:osteopontin is a modifier of kidney stone disease severity[J].Kidney Int,2005,68(3):938.

[3]郭滿,陳進(jìn)宏.骨橋蛋白與結(jié)石[J].外科理論與實(shí)踐,2011(2):217.

[4]JinZ K,Tian P X,Wang X Z,et al.Kidney injury molecule-1 and osteopontin:new markers for prediction of early kidney transplant rejection[J].Mol Immunol,2013,54(3/4):457.

[5]Irita J,Okura T,Jotoku M,et al.Osteopontin deficiency protects against aldosterone-induced inflammation,oxidative stress,andinterstitial fibrosisin the kidney[J].Am J Physiol Renal Physiol,2011,301(4):F833.

[6]Ichikawa H,Imano M,T akeyama Y,et al.Involvement of osteopontin as a core protein in cholesterol gallstone formation[J].J Hepatobiliary Pancreat Surg,2009,16(2):197.

[7]Xie Y,Sakatsume M,Nishi S,et al.Expression,roles,receptors,and regulation of osteopontin in the kidney[J].Kidney Int,2001,60(5):1645.

[8]Atmani F,Farell G,Lieske J C.Extract from Herniaria hirsuta coats calcium oxalate monohydrate crystals and blocks their adhesion to renal epithelial cells[J].J U rol,2004,172(4 Pt 1):1510.

[9]Lieske J C,Deganello S.Nucleation,adhesion,and internalization of calcium-containing urinary crystals by renal cells[J].J Am Soc Nephrol,1999,10(Suppl 14):S422.

[10]王瑩.骨橋蛋白及其受體在結(jié)石動物模型及細(xì)胞模型中的表達(dá):第十五屆全國泌尿外科學(xué)術(shù)會議[C].中國云南昆明,2008.