何 培，丁慧娟，劉芷成，劉 歡，申湘忠

(湖南人文科技學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)系，湖南婁底417000)

金銀花又名忍冬花、銀花、雙花、茶葉花等，為忍冬科植物，是我國(guó)常用中藥，金銀花常用于治療溫病發(fā)熱、熱毒血痢、癰瘍等癥，亦用于風(fēng)熱感冒、支氣管炎等病癥[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，金銀花具有抗病原微生物、抗炎、抗生育、解熱、保肝、止血、降血脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，臨床主要用于治療多種感染、各種炎癥、高熱癥、高血脂癥、腫瘤放療等[2]。金銀花中富含多種對(duì)人體健康有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]，諸如綠原酸、異綠原酸、揮發(fā)油、咖啡酸、黃酮化合物、三萜皂苷、木犀草素及無(wú)機(jī)元素等，具有很高利用價(jià)值。金銀花的主要成分為綠原酸、類(lèi)黃酮，而綠原酸是金銀花主要的抗菌成分，綠原酸含量的高低是目前衡量金銀花品質(zhì)優(yōu)劣的指標(biāo)之一[4]。提高金銀花制劑中綠原酸含量對(duì)保證金銀花制劑的藥效具有重要作用。

目前，綠原酸的提取多采用水煎煮、醇回流、動(dòng)態(tài)浸提法、超聲波法和微波法等[5-10]。國(guó)內(nèi)外對(duì)綠原酸不同提取工藝的評(píng)價(jià)眾說(shuō)紛紜，但是鑒于中國(guó)古老的煎藥方式，認(rèn)為水煎煮法對(duì)提取物藥有提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的缺點(diǎn)。近年來(lái)，微波在植物有效成分提取過(guò)程中的研究發(fā)展很快，由于微波具有穿透性和由內(nèi)向外的加熱方式等優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)代活性成分提取中的運(yùn)用越來(lái)越廣泛。為提高金銀花的利用率，結(jié)合現(xiàn)代提取方式[11-13]，本文采用微波預(yù)處理水浴加熱法進(jìn)行金銀花中綠原酸的提取實(shí)驗(yàn)，并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定綠原酸的濃度，運(yùn)用正交試驗(yàn)對(duì)較優(yōu)的提取方法進(jìn)行了研究。并探討了乙醇濃度、提取時(shí)間、溫度、醇用量、水用量、微波處理時(shí)間等6個(gè)因素對(duì)提取金銀花中綠原酸含量的影響。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)金銀花中綠原酸的提取進(jìn)行比較分析以確定金銀花中綠原酸的微波提取的最佳工藝。

一 實(shí)驗(yàn)部分

(一)儀器和試劑

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2501PC)，日本島津公司生產(chǎn);電子天平(FA2004A)，上海良平儀器儀表有限公司生產(chǎn);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2)，江蘇金壇市億通電子有限公司生產(chǎn);微波爐(WD800)，長(zhǎng)沙超揚(yáng)電器貿(mào)易有限公司生產(chǎn);循環(huán)水式真空泵(SHZ-D)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);微型植物試樣粉碎機(jī)(XY-500A)，浙江永康壽松儀器有限公司生產(chǎn);綠原酸標(biāo)樣，長(zhǎng)沙市有機(jī)試劑廠生產(chǎn);無(wú)水乙醇(AR)，衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司生產(chǎn);鹽酸(AR)，株洲石英化玻有限公司生產(chǎn)。

(二)實(shí)驗(yàn)方法

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0．2500g，用蒸餾水定容至250ml容量瓶中，然后準(zhǔn)確量取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0．0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0ml，分別用蒸餾水定容至50ml容量瓶，將溶液搖勻后配成各種標(biāo)準(zhǔn)濃度，用蒸餾水做參比液，采用UV-2501紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)掃描，確定綠原酸最大吸收波長(zhǎng)。在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定不同濃度的綠原酸的吸光度。

2．金銀花中綠原酸的提取

將100g市售金銀花洗凈，在電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥時(shí)間為24h。將干燥好的金銀花用微型植物試樣粉碎機(jī)粉碎，直至過(guò)55目篩，保存在試劑瓶中，稱(chēng)取2．0g預(yù)處理好的金銀花粉末置于100ml燒杯中，邊滴乙醇溶液邊攪拌使之濕潤(rùn)均勻，然后鋪平靜置10min，使溶液充分滲入金銀花組織內(nèi)。向預(yù)處理好的金銀花粉末中加水，恒溫提取，將提取液抽濾。將濾液加水定容到250ml的容量瓶中定容，再量取2ml的溶液加水定容到50ml的容量瓶中，然后在設(shè)定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度及濃度。

(三)單因素實(shí)驗(yàn)

1．微波預(yù)處理時(shí)間對(duì)綠原酸濃度的影響

在固定其它因素(乙醇濃度、乙醇用量、浸提水用量、浸提時(shí)間、浸提溫度)的條件下，分別在微波爐中對(duì)金銀花粉末處理 40s、50s、60s、70s和80s，然后水浴加熱，提取液定容，分別測(cè)定吸光度及濃度。

2．乙醇濃度對(duì)綠原酸濃度的影響

在固定其它因素條件下，分別使用60%、70%、80%、90%和95%的乙醇對(duì)金銀花粉末進(jìn)行預(yù)處理，然后水浴加熱，提取液定容，測(cè)定吸光度及濃度。

3．乙醇用量對(duì)綠原酸濃度的影響

在固定其它因素的條件下，分別采用2、3、4、5和6倍量的乙醇對(duì)金銀花粉末進(jìn)行處理，然后水浴加熱，提取液定容，測(cè)定吸光度及濃度。

4．浸提水用量對(duì)綠原酸濃度的影響

在固定其他因素的條件下，分別采用10、15、20、25和30倍的水量進(jìn)行水浴浸提，提取液定容，測(cè)定吸光度以及濃度。

5．浸提時(shí)間對(duì)綠原酸濃度的影響

在固定其他因素的條件下，分別采用40min、50min、60min、70min和80min的水浴時(shí)間進(jìn)行浸提，提取液定容，測(cè)定吸光度及濃度。

6．浸提溫度對(duì)綠原酸濃度的影響

在固定其他因素的條件下，分別采用50℃、60℃、70℃、80℃和90℃的水浴溫度進(jìn)行浸提，提取液定容，測(cè)定吸光度及濃度。

(四)正交實(shí)驗(yàn)

1．微波預(yù)處理?xiàng)l件的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，固定浸提條件，對(duì)預(yù)處理的3個(gè)因素(乙醇濃度、乙醇用量、微波預(yù)處理時(shí)間)各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9(33)正交實(shí)驗(yàn)(表1)，以綠原酸濃度作為指標(biāo)進(jìn)行考察。

表1 微波預(yù)處理因素水平表

2． 浸提條件的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，固定微波預(yù)處理?xiàng)l件，對(duì)浸提實(shí)驗(yàn)的3個(gè)因素(浸提時(shí)間、浸提水用量、水浴溫度)各取3個(gè)水平，進(jìn)行L9(33)正交實(shí)驗(yàn)(表2)，以綠原酸濃度作為指標(biāo)進(jìn)行考察。

表2 浸提條件因素水平表

二 結(jié)果與分析

(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對(duì)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的掃描見(jiàn)圖1，可以看出綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)在324．0nm處。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外掃描圖

以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度C(μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回歸方程Y=AX+B

式中:A=0．0525 B=-0．0022

X—綠原酸的濃度(μg/ml)，Y—吸光度，R2=0．9999，說(shuō)明綠原酸濃度在 0-20 μg/ml范圍內(nèi)，吸光度與綠原酸濃度的線性關(guān)系良好。

(二)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1．微波預(yù)處理時(shí)間對(duì)綠原酸提取的影響

不同微波預(yù)處理時(shí)間對(duì)綠原酸提取的影響見(jiàn)圖3。

圖3 微波預(yù)處理時(shí)間對(duì)綠原酸提取的影響

從圖3可以看出，當(dāng)微波預(yù)處理時(shí)間為60s時(shí)，綠原酸的濃度最高，提取效果最好。小于60s時(shí)，處理時(shí)間太短，滲透到細(xì)胞的乙醇不能完全汽化，組織破壞不完全;大于60s時(shí)，會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響綠原酸的產(chǎn)量。

2．乙醇濃度對(duì)綠原酸提取的影響

用不同乙醇濃度對(duì)金銀花進(jìn)行處理，不同濃度乙醇對(duì)綠原酸提取的影響見(jiàn)圖4。

圖4 乙醇濃度對(duì)綠原酸提取的影響

由于不同濃度的乙醇溶液對(duì)金銀花細(xì)胞膜的滲透效果是不同的，滲透細(xì)胞膜效果越好，微波對(duì)細(xì)胞組織的破壞效果越好，綠原酸的產(chǎn)量也就越好。從圖4可以看出，用濃度為80%的乙醇溶液處理金銀花，得到的綠原酸濃度最高，由此也可以看出濃度為80%的乙醇溶液對(duì)金銀花細(xì)胞膜的滲透效果最好。

3．乙醇用量對(duì)綠原酸提取的影響

用不同用量的同濃度乙醇溶液對(duì)金銀花進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 乙醇用量對(duì)綠原酸提取的影響

當(dāng)乙醇用量少時(shí)，金銀花粉末沒(méi)有很好地被浸濕，不能達(dá)到很好的處理效果;當(dāng)乙醇用量過(guò)多時(shí)，過(guò)多的乙醇在蒸發(fā)時(shí)會(huì)消耗一定的微波能，使?jié)B透入細(xì)胞內(nèi)的乙醇溶液揮發(fā)不夠充分，從而影響綠原酸的提取。從圖5可以看出，當(dāng)乙醇用量為5倍量時(shí)，綠原酸的濃度最高，所以用5倍量的乙醇提取效果會(huì)更好。

4．浸提水用量對(duì)綠原酸提取的影響

不同浸提水用量對(duì)綠原酸提取的影響見(jiàn)圖6。

圖6 浸提水用量對(duì)綠原酸提取的影響

在一般的提取實(shí)驗(yàn)中，加大溶劑的用量可以提高提取率。但是綠原酸比較特殊，在加水的過(guò)程中，PH會(huì)慢慢增加，會(huì)有部分的綠原酸分解，從而影響綠原酸的提取率。從圖6可以看出，當(dāng)提取水的用量為15倍量時(shí)，綠原酸的濃度最高，綠原酸提取的效果最好。

5．浸提時(shí)間對(duì)綠原酸提取的影響

浸提時(shí)間對(duì)于綠原酸的提取有一定的影響，浸提時(shí)間對(duì)綠原酸提取的影響見(jiàn)圖7。

圖7 浸提時(shí)間對(duì)綠原酸提取的影響

浸提時(shí)間與綠原酸在水中的溶解度有關(guān)，當(dāng)綠原酸的溶解度達(dá)到飽和時(shí)，延長(zhǎng)浸提時(shí)間不會(huì)增加綠原酸的濃度，反而綠原酸在光照下會(huì)有部分的分解，隨著時(shí)間的增加，綠原酸的濃度會(huì)慢慢降低。從圖7可以看出，當(dāng)浸提時(shí)間小于60min時(shí)，綠原酸的濃度不斷提高，到60min時(shí)達(dá)到最優(yōu)，大于60min后則會(huì)有部分綠原酸分解而使綠原酸濃度慢慢降低。

6．浸提溫度對(duì)綠原酸提取的影響

不同浸提溫度對(duì)綠原酸提取的影響見(jiàn)圖8。

圖8 浸提溫度對(duì)綠原酸提取的影響

升高浸提溫度，可以提高分子的熱運(yùn)動(dòng)，從而提高綠原酸的提取效率。但是綠原酸的性質(zhì)表明:溫度過(guò)高時(shí)，綠原酸容易分解。從圖8可以看出，當(dāng)浸提溫度小于70℃時(shí)，升高溫度有利于綠原酸的提取，綠原酸的濃度在不斷上升;當(dāng)浸提溫度為70℃時(shí)，綠原酸的濃度達(dá)到最大值;當(dāng)浸提溫度大于70℃時(shí)，綠原酸的濃度在不斷減小，說(shuō)明綠原酸在不斷地分解。實(shí)驗(yàn)得出綠原酸的最優(yōu)浸提溫度為70℃。

(三)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1．微波預(yù)處理實(shí)驗(yàn)的正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取預(yù)處理中影響綠原酸提取的3個(gè)因素(微波預(yù)處理時(shí)間、乙醇濃度和乙醇用量)進(jìn)行3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3中R值的大小可以看出，在金銀花中綠原酸微波提取的預(yù)處理實(shí)驗(yàn)部分，影響最大的條件為C(乙醇用量)，其次是A(乙醇濃度)，最后是B(微波預(yù)處理時(shí)間)。對(duì)K值進(jìn)行分析，得出最優(yōu)的微波預(yù)處理實(shí)驗(yàn)組合為A2B2C1，即乙醇濃度為80%，微波預(yù)處理時(shí)間60s，乙醇用量為4倍量。

表3 微波預(yù)處理正交實(shí)驗(yàn)表

2．浸提條件的正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)浸提條件中影響綠原酸提取的3個(gè)因素(浸提溫度、浸提時(shí)間和浸提水用量)進(jìn)行3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 浸提條件正交實(shí)驗(yàn)表

由表4中R值的大小可以看出，在金銀花中綠原酸的微波提取實(shí)驗(yàn)的浸提實(shí)驗(yàn)部分，影響最大的條件為D(浸提水用量)，其次為E(浸提水浴溫度)，最后是F(浸提時(shí)間)。對(duì)K值進(jìn)行分析，得出最優(yōu)的浸提實(shí)驗(yàn)組合為D2E2F1，即浸提水用量為 15倍，浸提水浴溫度為 70℃，浸提時(shí)間為50min。

3．最優(yōu)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)對(duì)微波預(yù)處理?xiàng)l件的正交實(shí)驗(yàn)和浸提條件的正交實(shí)驗(yàn)，可以得出金銀花中綠原酸的微波提取實(shí)驗(yàn)最佳的條件為:加入4倍量80%的乙醇溶液，微波預(yù)處理60s，然后加15倍量的蒸餾水在70℃的水浴溫度中提取50min，并進(jìn)行綠原酸的微波提取實(shí)驗(yàn)，得到綠原酸濃度為16．6758 mg·L-1，綠原酸的含量為8．34mg·g-1。

三 結(jié)論

用微波預(yù)處理水浴浸提法對(duì)金銀花中的綠原酸進(jìn)行提取，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行結(jié)果測(cè)量，通過(guò)對(duì)預(yù)處理實(shí)驗(yàn)中的3個(gè)因素和浸提實(shí)驗(yàn)中的3個(gè)因素進(jìn)行研究，確定了微波法提取綠原酸的最佳條件:4倍量80%的乙醇、微波預(yù)處理60s、15倍量的蒸餾水、水浴溫度為70℃、浸提時(shí)間為50min。在此最佳條件下進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，提取得到的綠原酸含量為8．34mg·g-1。采用微波預(yù)處理法提取金銀花中的綠原酸比傳統(tǒng)提取的方法得到的綠原酸的含量要高。實(shí)驗(yàn)得到的工藝可供工業(yè)生產(chǎn)作為參考。

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