顏 亮， 羅 滔， 蔡軍偉， 畢志斐， 胡巢鳳

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，國家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632;2南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣東廣州510515;3山西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，山西太原030001)

固有免疫(innate immunity)是多細(xì)胞生物抗御 病原體感染和抗腫瘤的第一道防線。固有免疫細(xì)胞通過表達(dá)模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，啟動(dòng)機(jī)體的生物防御機(jī)能。Toll樣受體［1］(Toll-like receptors，TLRs)是發(fā)揮固有免疫功能的關(guān)鍵PRRs，主要識(shí)別細(xì)胞外或作用于細(xì)胞表面的PAMPs，例如細(xì)菌脂多糖、肽聚糖、胞壁酸、病毒雙鏈RNA、細(xì)菌鞭毛蛋白等，其對(duì)PAMPs的識(shí)別由TLRs胞外富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine rich repeats，LRR)完成［2］。

然而機(jī)體在病理?xiàng)l件下也會(huì)出現(xiàn)PAMPs相關(guān)分子和相似的危險(xiǎn)信號(hào)，這些PAMPs相關(guān)分子和危險(xiǎn)信號(hào)存在于細(xì)胞內(nèi)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)和警示組織損傷。闡明機(jī)體對(duì)這些細(xì)胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)的識(shí)別機(jī)制是一個(gè)根本性的問題。2000年Hoffman等［3-4］相繼報(bào)道了人類常染色體顯性遺傳病家族性冷誘發(fā)蕁麻疹(familial cold urticaria，F(xiàn)CU)和MW綜合征(Muckle-Wells syndrome，MWS)的致病基因是編碼NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3(NALP3)的CIAS1基因。CIAS1基因的突變還可引起慢性嬰幼兒神經(jīng)皮膚關(guān)節(jié)綜合癥［5］，這些疾病實(shí)質(zhì)上均為自身炎癥性病變，以炎癥復(fù)合體(inflammasome)過度激活和產(chǎn)生過量炎癥細(xì)胞因子 IL-1β為特征。NALP3又稱 cryopyrin或 PYPAF1/NLRP3，主要在白細(xì)胞中表達(dá)。NALP3的N端是重要的熱蛋白樣結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)［6］，通過接頭蛋白 ASC 與其下游的信號(hào)效應(yīng)分子相聯(lián)系。中部是核苷酸偶聯(lián)結(jié)構(gòu)域(domain present in NAIP，CIITA，HET-E and TP-1，NACHT)［7］，具有同屬蛋白寡聚化募集的功能。C端的LRR結(jié)構(gòu)域與TLR胞外段結(jié)構(gòu)相似，由多個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)單位呈大致相互反向平行的 β-折疊和 α-螺旋構(gòu)成，具有分子之間相互作用和配體識(shí)別能力［8］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子被NALP3的LRR結(jié)構(gòu)域(NALP3-LRR)識(shí)別后，引起NALP3的寡聚化和分子活化，與炎癥性凋亡蛋白酶1形成炎癥復(fù)合體，參與炎癥細(xì)胞因子 IL-1β的生成和機(jī)體固有免疫調(diào)節(jié)［9］。

NALP3能被包括ATP、細(xì)菌毒素、病原體代謝產(chǎn)物、尿酸晶體、三硝基氯苯等激活［10-12］，推測(cè)其機(jī)制與NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域?qū)@些細(xì)胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)的識(shí)別有關(guān)，而NALP3發(fā)生基因突變引起自身炎癥性病變則可能導(dǎo)致LRR結(jié)構(gòu)域的識(shí)別功能紊亂和NALP3過度活化。至今關(guān)于內(nèi)源性蛋白分子如何與NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域相互作用甚少見報(bào)道。本研究運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)，以人NALP3-LRR基因序列構(gòu)建誘餌質(zhì)粒，對(duì)人胚肺文庫進(jìn)行酵母雙雜交文庫篩選，尋找與NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白質(zhì)分子，為進(jìn)一步闡明NALP3在固有免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用提供新的資料。

材料和方法

1 材料

pMyr人胚肺cDNA文庫質(zhì)粒(庫容為4×108cfu/L)和pSos質(zhì)粒(Stratagene)，cdc25H酵母細(xì)胞、酵母轉(zhuǎn)化、酵母質(zhì)粒提取所需各種試劑及YPAD、SD/glucose(－UL)、SD/galactose(－UL)培養(yǎng)平板，XL1-Blue感受態(tài)菌及分子克隆所用的常規(guī)試劑均由天津賽爾生物技術(shù)有限公司提供。

2 方法

2.1 克隆NALP3-LRR的cDNA序列及構(gòu)建含有NALP3-LRR序列的pSos誘餌質(zhì)粒 人軟骨組織通過液氮研磨，Trizol法提取總RNA，用Oligo dT為引物，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。設(shè)計(jì)含有BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)的PCR引物，克隆NALP3-LRR的cDNA序列。將回收的PCR產(chǎn)物與酶切后的線性質(zhì)粒16℃連接過夜。提取質(zhì)粒，酶切鑒定含有NALP3-LRR的陽性克隆。將NALP3-LRR序列與誘餌載體pSos連接，酶切鑒定選擇適當(dāng)?shù)目寺〗?jīng)測(cè)序確認(rèn)。

2.2 酵母轉(zhuǎn)化和誘餌蛋白自激活實(shí)驗(yàn) 常規(guī)制備感受態(tài)細(xì)胞，行酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。設(shè)置陽性對(duì)照組為pSos MAFB+pMyr MAFB和pSos MAFB+pMyr SB;陰性對(duì)照組為pSos MAFB+pMyr Lamin C和pSos Col I+pMyr MAFB，只有在galactose存在的前提下才能激活報(bào)告基因的表達(dá)。為了驗(yàn)證Bait蛋白NALP3-LRR是否具有自激活能力，設(shè)置轉(zhuǎn)化組別為:pSos bait(用于排除bait蛋白自身可定位于膜上)，pSos bait+pMyr SB(驗(yàn)證蛋白位于胞漿中)，pSos bait+pMyr或pMyr Lamin C(排除bait蛋白可能與myristlyation signal結(jié)合)。將在 25 ℃ SD/glucose(－UL)平板上生長(zhǎng)的酵母菌挑取在DDW中渦旋后各滴于 SD/glucose(－UL)和 SD/galactose(－UL)的平板上，25℃ 和37℃觀察4～6 d。

2.3 感受態(tài)酵母菌的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià) 使用2個(gè)對(duì)照平板來檢測(cè)溫度敏感突變體的突變頻率。第1對(duì)照組將75 μL用來制備酵母感受態(tài)的酵母培養(yǎng)物鋪于YPAD完全培養(yǎng)平板上，在37℃孵育6 d，出現(xiàn)5個(gè)克隆(小于30個(gè)克隆)，說明培養(yǎng)物中溫度敏感突變體的數(shù)量合格。第2對(duì)照平板為共轉(zhuǎn)化pSos和pMyr的酵母細(xì)胞，37℃孵育6 d，未出現(xiàn)克隆，符合要求。共轉(zhuǎn)化了pSos和pMyr的酵母細(xì)胞，在25℃孵育的SD/glucose(－UL)平板上生長(zhǎng)的克隆數(shù)為130左右。按公式計(jì)算轉(zhuǎn)化效率為1.3×103cfu/μg，符合轉(zhuǎn)化效率應(yīng)在0.5 ×103～1 ×104cfu/μg的要求。

2.4 酵母的文庫篩選實(shí)驗(yàn) 將NALP3-LRR-pSos質(zhì)粒和pMyr人胚肺cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母的感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化反應(yīng)混合物鋪在SD/galactose(－UL)瓊脂平板上。25℃倒置孵育平板48 h，隨后轉(zhuǎn)入37℃孵育。7 d以后，從37℃半乳糖平板上的文庫篩選轉(zhuǎn)化物中挑取克隆，將細(xì)胞重鋪在SD/glucose(－UL)瓊脂平板上，在22～25℃孵育48 h。再將其分別重鋪在2個(gè)SD/glucose(－UL)平板和1個(gè)SD/galactose(－UL)平板上，其中一個(gè)SD/glucose(－UL)平板在25℃孵育作為保存板，另外一個(gè)SD/glucose(－UL)平板和SD/galactose(－UL)平板在37℃孵育約48 h。48 h后觀察各個(gè)平板的克隆生長(zhǎng)情況，找出37℃下在SD/galactose(－UL)平板上生長(zhǎng)、而在SD/glucose(－UL)平板上不生長(zhǎng)的克隆。將這些克隆再次鋪板，置不同溫度培養(yǎng)，重復(fù)驗(yàn)證后視為可能的陽性克隆。

2.5 陽性克隆的酵母回交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 擴(kuò)增含有陽性克隆的酵母細(xì)胞后通過化學(xué)及物理裂解的方法提取其中的文庫質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化上述質(zhì)粒DNA至大腸桿菌后，分離純化文庫質(zhì)粒DNA。酶切鑒定文庫質(zhì)粒DNA中所含外片段的大小進(jìn)行比對(duì)分析。再次共轉(zhuǎn)文庫與誘餌DNA，對(duì)篩選得到的陽性克隆進(jìn)行回交驗(yàn)證。最后測(cè)序分析陽性克隆的序列并做生物信息學(xué)分析。

2.6 NALP3-LRR與陽性克隆基因在293T細(xì)胞的共表達(dá)和免疫共沉淀驗(yàn)證 對(duì)經(jīng)酵母文庫篩選獲得的陽性蛋白進(jìn)行基因序列克隆，構(gòu)建相應(yīng)的真核表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定后送測(cè)序確認(rèn)。用Lipofectamine 2000將含有相關(guān)陽性蛋白基因的真核表達(dá)載體與含有NALP3-LRR基因的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱37℃ 培養(yǎng)72 h后，裂解細(xì)胞提取蛋白。Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)。

分別將NALP3-LRR/pCD3-CMYC與CCNH/pCD3-HA、NALP3-LRR/pCD3-CMYC 與 AIBVORF1a/pCD3-HA、NALP3-LRR/pCD3-CMYC 與PALM3/pCD3-HA共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收獲細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞提取蛋白。取 c-Myc單抗交聯(lián)蛋白A瓊脂糖珠，用裂解緩沖液洗3次，將預(yù)處理過的蛋白A瓊脂糖珠加入和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中，4℃ 緩慢搖晃孵育4 h，使抗體與蛋白A瓊脂糖珠偶聯(lián)。免疫沉淀反應(yīng)后，4℃、3 000 r/min離心將瓊脂糖珠離心至管底，小心吸去上清，瓊脂糖珠用裂解緩沖液洗，最后加入2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min。配制分離膠為10%的SDS-PAGE凝膠，上樣后100V電壓電泳。電泳分離后的蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，浸入Blotto封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，分別與Ⅰ抗和Ⅱ抗孵育，最后加入化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2.7 用分子模擬軟件Discovery StudioTM(Accelrys)對(duì)NALP3-LRR進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模建，使用Vector NTI Suite軟件、ExPASy的PROSITE數(shù)據(jù)庫、DTU CBS服務(wù)器上的NetPhos 2.0 Server程序和Stanford大學(xué)開發(fā)的SAPS等工具和數(shù)據(jù)庫分析NALP3-LRR序列的功能位點(diǎn)。

結(jié) 果

1 NALP3-LRR的cDNA序列克隆和NALP3-LRR-pSos誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建

常規(guī)方法提取總 RNA，A260/A280=1.9，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，28S/18S大約為1∶1～2∶1之間。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切鑒定片段大小正確，見圖1A。將NALP3-LRR序列與誘餌載體pSos連接，酶切后電泳鑒定，顯示1、3、5號(hào)克隆含有大小正確的目的片段，見圖1B，其中1號(hào)克隆經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤，讀碼框正確，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1.Identification of PCR clone of NALP3－LRR cDNA(A)and NALP3－LRR－pSos bait plasmid(B)by enzyme digestion with BamH I and Sal I.M:DNA marker.圖1PCR克隆的NALP3-LRR cDNA序列和NALP3-LRR-pSos誘餌質(zhì)粒的酶切鑒定

2 酵母轉(zhuǎn)化和自激活實(shí)驗(yàn)

將cdc25H酵母細(xì)胞分別畫線于 SD/－Trp、SD/－Leu、SD/－His、SD/－Ura和 YPDA，22 ～25 ℃下生長(zhǎng)4～6 d。結(jié)果只在YPDA上長(zhǎng)出克隆，其余SD平板上均無克隆出現(xiàn)。將cdc25H酵母細(xì)胞分別畫線于2塊YPDA平板，一個(gè)放于22～25℃培養(yǎng)，另一個(gè)放于37℃培養(yǎng)，共觀察4 d，37℃條件下無菌落生長(zhǎng)。

酵母轉(zhuǎn)化對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，只有在galactose存在的前提下才能激活報(bào)告基因的表達(dá)，實(shí)際結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，見表1。

表1 酵母轉(zhuǎn)化證實(shí)galactose的存在激活報(bào)告基因Table 1.Yeast transformation indicated galactose activated the reporter gene

自激活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2組轉(zhuǎn)化后的酵母菌25℃在glucose和galactose平板上均有生長(zhǎng);37℃在glucose平板上，2組均無生長(zhǎng)。在galactose平板上，NAPL3-LRR-pSos+pMyr SB生長(zhǎng)，而NAPL3-LRR-pSos+pMyr Lamin C不生長(zhǎng)，表明NALP3無自激活作用，可用于酵母文庫篩選實(shí)驗(yàn)，見圖2。

Figure 2.The growth of the co-transformants under different conditions for testing the possibility of self-activation by NALP3-LRR.1:NALP3-LRR-pSos+pMyr Lamin C;2:NALP3-LRR-pSos+pMyr SB.圖2 自激活實(shí)驗(yàn)顯示共轉(zhuǎn)子在不同條件下的生長(zhǎng)情況

3 從人胚肺cDNA文庫篩選與NALP3-LRR相互作用的陽性克隆

將NALP3-LRR-pSos質(zhì)粒和pMyr人胚肺cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化后的酵母的感受態(tài)細(xì)胞按照方法2.4培養(yǎng)，找出37℃下在SD/galactose(－UL)平板上生長(zhǎng)，而在SD/glucose(－UL)平板上不生長(zhǎng)的克隆，再次驗(yàn)證后視為可能的陽性克隆，圖3是部分陽性克隆的例子，可見第2號(hào)克隆在 SD/glucose(－UL)條件下，25℃能正常生長(zhǎng)，37℃則無法生長(zhǎng)。該克隆在SD/galactose(－UL)條件下，37℃也能生長(zhǎng)。將選中的克隆重新培養(yǎng)篩選驗(yàn)證，共得到4個(gè)陽性克隆。擴(kuò)增4個(gè)陽性克隆的酵母細(xì)胞提取其中含有的文庫質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞后小量提取質(zhì)粒。用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，片段大小與預(yù)測(cè)相符?；亟粚?shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明所選克隆與NALP3-LRR在酵母細(xì)胞內(nèi)有相互作用，見圖4。

Figure 3.Identification and selection of a positive clone.圖3 鑒別和挑選陽性克隆

Figure 4.Further confirmation of the positive clones by the yeast backcross verification.圖4 回交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證陽性克隆

陽性克隆經(jīng)測(cè)序和生物信息學(xué)分析表明，克隆N1為人細(xì)胞周期蛋白H(Homo sapiens cyclin H，CCNH);克隆 N2為 Homo sapiens paralemmin-3(PALM3);克隆N5為KRAS，是Cytotrap系統(tǒng)中一背景性假陽性蛋白;克隆N6為禽傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，AIBV)Ca199毒株的ORF1a蛋白(AIBV-ORF1a)。

4 與NALP3-LRR相互作用的蛋白質(zhì)在人腎上皮細(xì)胞的表達(dá)及免疫共沉淀驗(yàn)證

成功構(gòu)建相應(yīng)的真核表達(dá)載體NALP3-LRR/pCD3-CMYC、CCNH/pCD3-HA、PALM3/pCD3-HA 和AIBV-ORF1a/pCD3-HA，經(jīng)酶切后均可見到大小正確的插入片段。測(cè)序結(jié)果顯示序列正確，無任何突變或缺失，讀碼框正確。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，經(jīng)Western blotting獲得單一清晰條帶證實(shí)這些蛋白均能在人腎上皮細(xì)胞表達(dá)，見圖5。

Figure 5.The expression of positive proteins in 293T cells detected by Western blotting.圖5 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)篩選的陽性蛋白均能在人腎上皮細(xì)胞293T表達(dá)

將真核表達(dá)載體NALP3-LRR/pCD3-CMYC分別與 CCNH/pCD3-HA、PALM3/pCD3-HA 和 AIBVORF1a/pCD3-HA共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，細(xì)胞裂解物和經(jīng)CMYC單抗瓊脂糖珠結(jié)合的沉淀物均可檢測(cè)到NALP3-LRR蛋白的存在(圖略)。NALP3-LRR基因與CCNH基因共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物和NALP3-LRR基因與AIBV-ORF1a基因共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物經(jīng)與CMYC單抗瓊脂糖珠結(jié)合后，在瓊脂糖珠結(jié)合物中均可檢測(cè)到2種蛋白的存在，表明2種蛋白之間存在相互作用。NALP3-LRR與PALM3基因共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物與CMYC單抗瓊脂糖珠結(jié)合后，在瓊脂糖珠結(jié)合物中只能檢測(cè)到NALP3-LRR的存在，未檢出PALM3蛋白，表明2種蛋白之間沒有相互作用，見圖6。

Figure 6.Co-immunoprecipitation of NALP3-LRR with the positive proteins.The anti-HA antibody was used as the first antibody for binding to the positive proteins.Lane 1:the sample was the cell lysate before co-IP by Sepharose 4B conjugated with the anti-CMYC antibody;Lane 2:the sample was the precipitates of the cell lysate after co-IP by Sepharose 4B conjugated with the anti-CMYC antibody.圖6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確認(rèn)與NALP3-LRR相互作用的蛋白

5 NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域的分子模擬和功能預(yù)測(cè)

雖然NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸，但無亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。對(duì)NALP3的分子基序搜尋顯示N-糖基化位點(diǎn)(N-glycosylation site)主要位于LRR結(jié)構(gòu)域，原核生物膜脂蛋白脂質(zhì)附著位點(diǎn)(prokaryotic membrane lipoprotein lipid attachment site)也位于LRR結(jié)構(gòu)域(第831～841位氨基酸)，并存在12個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)。分子結(jié)構(gòu)保守性分析結(jié)果表明，LRR結(jié)構(gòu)域在整個(gè)NALP3分子中保守性最高。對(duì)NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域的三維分子模建可見該結(jié)構(gòu)域有典型的TLR胞外PAMPs識(shí)別的相似結(jié)構(gòu)，其外緣為α螺旋，內(nèi)緣為β折疊，兩者交替反相折疊呈馬蹄形。該區(qū)負(fù)電荷分布占明顯優(yōu)勢(shì)，重心位于近羧基β折疊及β折疊的羧基端轉(zhuǎn)彎部位，整個(gè)模建的負(fù)靜電勢(shì)分布呈拳擊手套狀，有正電勢(shì)分布位于手套掌根部。

討 論

運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)，本文首次發(fā)現(xiàn)在酵母細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞內(nèi)，人NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域蛋白與人細(xì)胞周期蛋白H和禽傳染性支氣管炎病毒發(fā)生了相互作用。為了確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實(shí)驗(yàn)過程中采取了嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，所有DNA克隆產(chǎn)物都在酶切鑒定后經(jīng)序列測(cè)定確認(rèn)，保證序列正確，無任何突變或缺失且讀碼框正確，能表達(dá)正確的蛋白質(zhì)。酵母雙雜交對(duì)人胚肺cDNA文庫的篩選每個(gè)實(shí)驗(yàn)均設(shè)置嚴(yán)格對(duì)照，排除了NALP3-LRR蛋白自激活的可能性。對(duì)能與NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用的陽性克隆采用了重復(fù)實(shí)驗(yàn)、回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，最后共轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞293T通過免疫共沉淀檢驗(yàn)方予確認(rèn)。

NALP3是NALP分子家族的典型代表，其N端是PYRIN結(jié)構(gòu)域，C端是LRR結(jié)構(gòu)域，NACHT結(jié)構(gòu)域位于分子的核心部位，這樣的結(jié)構(gòu)使其既有信號(hào)識(shí)別能力，又有自身寡聚化和與效應(yīng)分子形成復(fù)合物的功能，是構(gòu)成炎癥復(fù)合體的重要成分。本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道NALP3的NACHT結(jié)構(gòu)域存在能與ATP和Mg2+結(jié)合的Walker A和Walker B基序，該基因的主要致病突變點(diǎn)與此結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LRR區(qū)域存在與Ca2+和多糖結(jié)合的位點(diǎn)［13］。

對(duì)PYRIN結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)關(guān)聯(lián)機(jī)制和NACHT結(jié)構(gòu)域的同源寡聚化已有較多的研究資料，但至今尚缺少關(guān)于NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域識(shí)別PAMPs和與胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)相互作用的直接證據(jù)。雖然大量的研究已明確細(xì)胞內(nèi)多種PAMPs和細(xì)胞損傷產(chǎn)生的信號(hào)分子可激活NALP3炎癥復(fù)合體，這些信號(hào)分子是否通過LRR結(jié)構(gòu)域進(jìn)行識(shí)別尚屬推測(cè)。本研究證明NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域能識(shí)別蛋白質(zhì)分子，這種物理性相互作用對(duì)該結(jié)構(gòu)域是NALP3分子的信號(hào)識(shí)別機(jī)構(gòu)的觀點(diǎn)提供了重要的證據(jù)。而我們對(duì)LRR結(jié)構(gòu)域的分子模擬分析提示該區(qū)域是整個(gè)NALP3分子中保守性最高的部分，特殊的電荷分布使其易于通過電荷相互作用與其它分子相結(jié)合。LRR結(jié)構(gòu)域的多個(gè)糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)提示某種調(diào)節(jié)機(jī)制的存在。NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域和TLR胞外段能與PAMPs識(shí)別的LRR結(jié)構(gòu)域相似［14］，外緣為α螺旋，內(nèi)緣為β折疊，兩者交替反相折疊的馬蹄形結(jié)構(gòu)也易于形成口袋狀的活性中心。

NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域能識(shí)別AIBV-ORF1a蛋白，和人們長(zhǎng)期以來認(rèn)為該分子結(jié)構(gòu)是細(xì)胞內(nèi)PAMPs感受器的推測(cè)相符。AIBV是冠狀病毒(coronavirus)家族成員，屬于包膜型正鏈RNA病毒，ORF1a基因是冠狀病毒的保守基因。AIBV感染是對(duì)各種家禽威脅最大的呼吸系統(tǒng)傳染致病原?；蚪M數(shù)據(jù)分析顯示，SARS冠狀病毒與AIBV冠狀病毒北京分離株存在50%的同源性［15］，SARS冠狀病毒與多個(gè)AIBV病毒株存在不同程度的序列重組現(xiàn)象，氨基酸取代類型上也有較大的相似性［16］?？茖W(xué)家在研制針對(duì)SARS冠狀病毒的疫苗時(shí)都重視借鑒過往制備AIBV疫苗的經(jīng)驗(yàn)［17］。雖然AIBV并非人類的致病病毒，了解NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域識(shí)別AIBV病毒蛋白的意義，在于對(duì)呼吸系統(tǒng)有感染能力的冠狀病毒對(duì)人類的威脅越來越大，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為探討機(jī)體識(shí)別這一類病原體并啟動(dòng)固有免疫機(jī)制提供了新思路，對(duì)研究病毒性呼吸系統(tǒng)感染的治療和相關(guān)疫苗的制備，以及對(duì)人類抗御傳染性呼吸道致病原，提高自身抵抗力均有重要意義。

細(xì)胞周期蛋白H為單域結(jié)構(gòu)，是動(dòng)植物普遍存在的細(xì)胞周期蛋白，在細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相均有表達(dá)，通過與CDK7結(jié)合形成CAK，促進(jìn)多個(gè)CDK的磷酸化，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。人細(xì)胞周期蛋白H能與P53蛋白直接相互作用，使之磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖。至今，尚未有關(guān)于人細(xì)胞周期蛋白H直接參與固有免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)的報(bào)道。眾所周知，增生是炎癥反應(yīng)的主要病理過程之一，大量研究資料表明，炎癥反應(yīng)影響細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)［18］;使用細(xì)胞周期抑制劑能減輕炎癥性神經(jīng)損傷和肺損傷;克氏錐蟲感染可刺激細(xì)胞增生，細(xì)胞周期蛋白表達(dá)上調(diào)，感染細(xì)胞呈炎癥表型［19-21］;細(xì)胞周期抑制性調(diào)節(jié)物p21也能抑制巨噬細(xì)胞生成IL-1β［22］。有報(bào)道稱NALP3的炎癥復(fù)合體機(jī)制還參與了代謝綜合癥、II型糖尿病、器官重塑性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化和慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病過程，由此引起的細(xì)胞增殖過程異常理應(yīng)有細(xì)胞周期蛋白的參與。既然人細(xì)胞周期蛋白H調(diào)節(jié)多種細(xì)胞周期蛋白的活性，其作為參與炎癥反應(yīng)和固有免疫調(diào)節(jié)的可能性也是存在的。值得注意的是，細(xì)胞周期蛋白H大多定位于細(xì)胞核［23］，與本實(shí)驗(yàn)NALP3-LRR蛋白定位于胞漿及膜結(jié)構(gòu)有區(qū)別。NALP3可能通過對(duì)細(xì)胞周期蛋白H的識(shí)別影響其入核發(fā)揮作用，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖進(jìn)程，或者細(xì)胞周期蛋白H還具有與周期調(diào)節(jié)不同的功能也是值得深入研究的新課題。例如，高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的定位和功能就主要在細(xì)胞核內(nèi)，但某些組織細(xì)胞在特定情況下能主動(dòng)分泌HMGB1到胞外誘發(fā)炎癥反應(yīng)并能被TLR識(shí)別。本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道PYRIN蛋白家族成員存在較復(fù)雜的基因多態(tài)性變化［24］，深入探討NALP3-LRR與細(xì)胞周期蛋白H的相互作用將有助于闡明固有免疫和細(xì)胞增殖的關(guān)系和調(diào)節(jié)機(jī)制。

雖然我們的研究在細(xì)胞水平(包括酵母細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞)上證實(shí)NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域與人細(xì)胞周期蛋白H和AIBV-ORF1a蛋白存在相互作用，但實(shí)驗(yàn)條件是處于體外人工轉(zhuǎn)染高表達(dá)狀態(tài)下。進(jìn)一步研究在生理及病理狀態(tài)下NALP3分子與這些蛋白的相互作用將有助于闡明NALP3作為細(xì)胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)感受器的識(shí)別機(jī)制。

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