黃郁凱， 李曉紅， 潘 宇， 林秋雄， 朱杰寧， 江雪燕， 葉力通， 余細(xì)勇

肌肉營(yíng)養(yǎng)不良是一種X連鎖隱性遺傳病，其中Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良是最常見與最重要的一種類型，主要發(fā)生在兒童身上，大多數(shù)患兒死于20歲前，目前沒(méi)有比較好的治療方法。干細(xì)胞移植呈現(xiàn)出比較好的前景，其中在骨骼肌里面存在的骨骼肌干細(xì)胞，為治療Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良提供了一種新的治療策略［1-2］。骨骼肌干細(xì)胞也稱骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，主要存在于肌纖維的肌膜層與基底膜之間，具有自我更新、多向分化的能力，在骨骼肌的損傷修復(fù)中起著重要的作用，并在心肌等疾病的自身修復(fù)中顯示了良好的臨床應(yīng)用前景［3-4］。但肌肉來(lái)源的干細(xì)胞在成年大鼠骨骼肌中含量較低，目前的分離培養(yǎng)方法主要是差速貼壁法和組織塊法［5-6］，存在消化時(shí)間長(zhǎng)、純化效率低、培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞易分化等問(wèn)題，影響了種子細(xì)胞的批量獲取，進(jìn)而阻礙了自體細(xì)胞移植的研究。懸浮培養(yǎng)是指細(xì)胞在低速貼壁的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，它能模擬組織三維結(jié)構(gòu)，最大限度維持細(xì)胞的分化潛能。另外，在懸浮的狀態(tài)下，分化的成體細(xì)胞會(huì)停止生長(zhǎng)而干細(xì)胞會(huì)繼續(xù)快速生長(zhǎng)、逐漸克隆成細(xì)胞團(tuán)，因此對(duì)純化干細(xì)胞有比較好的效果［7-8］。最近研究表明從小鼠和人的骨骼肌里能分離出骨骼肌干細(xì)胞并在懸浮培養(yǎng)的條件下長(zhǎng)成細(xì)胞團(tuán)［9］，但相關(guān)分離培養(yǎng)方法尚未在成年大鼠中建立，所以本研究的目標(biāo)是探索成年大鼠骨骼肌干細(xì)胞的分離和懸浮培養(yǎng)方法，為成年大鼠骨骼肌干細(xì)胞的相關(guān)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究打下基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動(dòng)物

成年SD大鼠，雄性，約250 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 主要試劑

胰蛋白酶購(gòu)自廣州威佳公司，中性蛋白酶購(gòu)自Roche，Ⅰ、Ⅳ型膠原酶購(gòu)自 Gibco，配對(duì)盒蛋白 7(paired box protein 7，Pax7)單克隆抗體購(gòu)自博奧森公司，DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Hyclone;表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購(gòu)自 Peprotech，Ultra-Low Attachment 6孔板購(gòu)自Corning，40 μm濾網(wǎng)購(gòu)自BD。

表1 各基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物Table 1.Quantitative real-time RT-PCR primers

3 主要方法

3.1 骨骼肌干細(xì)胞的分離 無(wú)菌條件下自約250 g的SD大鼠股四頭肌取3～5 g肌肉，將其移入盛有雙抗PBS的培養(yǎng)皿中，剔除筋膜后剪1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，再轉(zhuǎn)移到盛有1 g/L中性蛋白酶、1 g/LⅣ型膠原酶、2 g/LⅠ型膠原酶和2 g/L胰蛋白酶混合消化液的50 mL離心管中，37℃水浴箱中消化40 min，每5 min搖1次，最后200目不銹鋼網(wǎng)篩過(guò)濾到50 mL離心管中，加入5 mL FBS終止消化，1 200 r/min和離心10 min，棄上清。用含有20 μg/L EGF和20 μg/L bFGF的DMEM/F12重懸，種入U(xiǎn)ltra-Low Attachment 6孔板中，并于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

傳統(tǒng)差速貼壁法:獲得的單細(xì)胞混懸液接種到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)2 h后將培養(yǎng)液及非貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增以去除未消化纖維碎片和易貼壁的成纖維細(xì)胞。

3.2 骨骼肌干細(xì)胞團(tuán)的形成 每隔1 d加入500 μL新鮮的培養(yǎng)基，3 d后，將懸浮培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管內(nèi)，讓小細(xì)胞團(tuán)沉淀30 min后，半量換液。當(dāng)觀察到大細(xì)胞團(tuán)的形成時(shí)，用40 μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，然后接種到6孔板中培養(yǎng)，繼續(xù)觀察。

3.3 總RNA的提取和qRT-PCR 用TRIzol提取骨骼肌干細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，熒光定量PCR過(guò)程使用SYBR? Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time)試劑盒。各引物序列見表1。

3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將接種于載玻片上的骨骼肌干細(xì)胞用PBS洗3次，每次3 min;多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，每次3 min;加入抗 pax7抗體，常溫孵育60 min，PBS洗3次，每次3min;加入帶熒光標(biāo)記的Ⅱ抗，常溫孵育60 min后，PBS洗3次，每次3 min;加入DAPI染料，常溫孵育5 min，PBS洗3次，每次3 min;水溶性明膠封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

3.5 細(xì)胞的多能性特征鑒定

3.5.1 成脂分化誘導(dǎo) 成脂分化培養(yǎng)基成分為:DMEM/F12、1 mmol/L地塞米松、10 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、100 mmol/L吲哚美辛、10 mg/L胰島素、10%FBS和1%雙抗。將配置好的成脂分化培養(yǎng)基加入到貼壁的骨骼肌干細(xì)胞中，每3 d換1次液，2周后，oil red O染色觀察。

3.5.2 成骨分化誘導(dǎo) 骨分化培養(yǎng)基成分為:DMEM/F12、10% FBS、50 mg/L L-抗壞 血 酸、10 mmol/L甘油磷酸、100 nmol/L地塞米松和1%雙抗。將配置好的成骨分化培養(yǎng)基加入到貼壁的骨骼肌干細(xì)胞中，每3 d換1次液，2周后，Alizarin red S染色觀察。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 骨骼肌干細(xì)胞的分離和細(xì)胞團(tuán)的形成

經(jīng)酶消化分離出的骨骼肌干細(xì)胞呈現(xiàn)圓形或長(zhǎng)梭形亮點(diǎn)，懸浮于培養(yǎng)液中。在低吸附6孔板中能逐漸長(zhǎng)成細(xì)胞團(tuán)，2～3 d可觀察到細(xì)胞團(tuán)的形成，5～7 d有大細(xì)胞團(tuán)的形成，呈球形、輪廓光滑透亮。把細(xì)胞團(tuán)種入到6孔板中，1 d后大部分細(xì)胞團(tuán)會(huì)貼壁，2 d后可見有細(xì)胞開始從細(xì)胞團(tuán)中爬出來(lái)，猶如太陽(yáng)狀，當(dāng)細(xì)胞全部爬出來(lái)后，太陽(yáng)狀慢慢消失，與傳統(tǒng)差速貼壁培養(yǎng)方法相比，相同培養(yǎng)時(shí)間下的細(xì)胞輪廓更光滑透亮，見圖1。

Figure 1.The growth process of skeletal muscle stem cells(×200).A ～D:suspension culture at 1，3，5 and 8 d;E～F:adherent culture at 2 and 5 d;G:the cell culture for 7 d with the traditional method.圖1 骨骼肌干細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程

2 骨骼肌干細(xì)胞的鑒定

2.1 qRT-PCR檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物和骨骼肌干細(xì)胞標(biāo)志物 和傳統(tǒng)差速貼壁方法相比，新方法所獲細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog、Oct4和骨骼肌干細(xì)胞標(biāo)志物Myf5、Pax7有比較高的表達(dá)，這表明該方法得到的細(xì)胞純度更高，干性更好，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of Nanog，Oct4，Myf5 and Pax7 in skeletal muscle stem cells.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs traditional method.圖2 骨骼肌干細(xì)胞Nanog、Oct4、Myf5和 Pax7 mRNA的表達(dá)

2.2 骨骼肌干細(xì)胞免疫化學(xué)染色 和傳統(tǒng)差速貼壁法相比，Pax7在懸浮培養(yǎng)法獲得的骨骼肌干細(xì)胞中的表達(dá)更強(qiáng)，這也表明該方法得到的骨骼肌干細(xì)胞純度更高，見圖3。

Figure 3.The expression of Pax7 in skeletal muscle stem cells obtained by the new method and the traditional method(immunocytochemical staining，×400).圖3 骨骼肌干細(xì)胞的免疫化學(xué)染色

3 細(xì)胞的多能性特征鑒定

3.1 肌管的形成 骨骼肌干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)7 d左右融合到60%～70%，開始有散在和方向不一致的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞相互融合，形成短小的肌管細(xì)胞，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞密度增大，細(xì)胞之間的融合更為廣泛，肌管細(xì)胞的形成明顯增加。倒置相差顯微鏡下可見，見圖4A。

3.2 成脂分化誘導(dǎo) 用成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)10 d后，能看到小脂滴的形成，逐漸變大變多，用oil red O染色顯示為紅色，見圖4B。

3.3 成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo) 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞慢慢長(zhǎng)滿，能觀察到一些晶體的形成，用Alizarin red S染色時(shí)，顯示為橙紅色，見圖4C。

Figure 4.Multi-lineage differentiation capacity of skeletal muscle stem cells(×200).A:skeletal muscle stem cells differentiated into myotubes;B:verification of lipid accumulation by staining with oil red O;C:Alizarin red S staining of calcium phosphate.圖4 骨骼肌干細(xì)胞的多能性鑒定

討 論

骨骼肌干細(xì)胞存在于肌纖維的肌膜層與基底膜之間，當(dāng)骨骼肌組織受到損傷時(shí)這些靜息期的干細(xì)胞就會(huì)被激活并分裂增殖分化相互融合完成創(chuàng)面修復(fù)。目前骨骼肌干細(xì)胞因具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)而被臨床認(rèn)為是一種理想細(xì)胞:(1)自體來(lái)源取材方便，易于在體外擴(kuò)增;(2)骨骼肌是藥物注射的常用組織，具有一定的耐受性;(3)能高水平表達(dá)有活性的重組蛋白并具有分泌性;(4)移植后可與宿主的肌肉細(xì)胞融合形成多核肌細(xì)胞，延長(zhǎng)細(xì)胞存活期;(5)肌肉組織高度血管化，使分泌出的重組蛋白直接進(jìn)入血液循環(huán);(6)移植后不干擾鄰近組織的正常生理功能，臨床應(yīng)用時(shí)更加簡(jiǎn)便安全。

考慮到成年骨骼肌干細(xì)胞的治療潛能，探索其高效分離、純化和擴(kuò)增方法是非常必要的。傳統(tǒng)的分離方法常用膠原酶、胰蛋白酶消化或者組織塊法獲得骨骼肌干細(xì)胞［11-13］，但由于衛(wèi)星細(xì)胞是一種位于肌纖維的肌膜與基底膜之間的組織干細(xì)胞，細(xì)胞連接緊密，能抵抗一般消化酶的作用。本研究采用混合酶可以發(fā)揮疊加作用，使肌肉組織充分分解、消化，有利于簡(jiǎn)便、快捷地分離出骨骼肌干細(xì)胞。在骨骼肌干細(xì)胞純化方面，傳統(tǒng)的純化手段包括差速貼壁和Percoll液梯度離心法［10-12］，但存在程序復(fù)雜、細(xì)胞損失大、純度不夠高等缺點(diǎn)。最近有報(bào)道從人骨骼肌里通過(guò)懸浮培養(yǎng)的方法分出了骨骼肌干細(xì)胞團(tuán)，并發(fā)現(xiàn)通過(guò)懸浮培養(yǎng)能很好地維持骨骼肌干細(xì)胞的干性，并能達(dá)到批量擴(kuò)增的目的［9］。目前能否用懸浮培養(yǎng)的方法從成年大鼠骨骼肌中培養(yǎng)出細(xì)胞團(tuán)尚未有報(bào)道，所以本實(shí)驗(yàn)旨在建立懸浮培養(yǎng)法獲得成年大鼠骨骼肌干細(xì)胞團(tuán)的方法。越來(lái)越多的研究表明，細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞增殖、分化、干性維持有很大的影響［13］。在細(xì)胞成團(tuán)培養(yǎng)中懸浮培養(yǎng)起到了非常大的作用，因?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)法還能模擬體內(nèi)的三維環(huán)境，對(duì)維持干細(xì)胞的干性和分化潛能有很大的作用，它在脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)中也得到了證實(shí)［7］。

本研究觀察到，很多單個(gè)細(xì)胞能慢慢擴(kuò)增成一個(gè)細(xì)胞團(tuán)，表現(xiàn)出較好的自我更新能力。從這些細(xì)胞團(tuán)獲得的細(xì)胞能高表達(dá)骨骼肌干細(xì)胞標(biāo)志物Pax7和Myf5，其中Myf5在調(diào)節(jié)骨骼肌分化過(guò)程中最早出現(xiàn)，缺乏Myf5蛋白的骨骼肌細(xì)胞會(huì)丟失原有的肌肉形態(tài)［14］。另外，骨骼肌干細(xì)胞還表達(dá)了干性因子Nanog和Oct4，這些因子能維持胚胎干細(xì)胞的多功能性和自我更新能力，說(shuō)明該方法獲得的細(xì)胞是干性較好、還處于分化上游階段的干細(xì)胞［15-17］。

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