熊國吟， 羅小鵬， 楊昇炎， 徐 穎， 董 軍△

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種眼科常見的遺傳性疾病。全球發(fā)病率約在1/3 500［1］。其病理過程為視網(wǎng)膜感光細(xì)胞逐漸凋亡，最終導(dǎo)致中心視力的全部喪失。其視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)a波和b波波形減弱甚至熄滅，視覺眼電圖(electro-oculogram，EOG)波形光峰值和暗谷值均減小，甚至呈平坦型。眼底可觀察到骨細(xì)胞樣色素沉積。RP的遺傳方式多樣，單基因遺傳占大多數(shù)。目前尚無長期有效的預(yù)防和治愈RP的方法。大多數(shù)患者RP的發(fā)生是由于單個(gè)基因發(fā)生變異，從而引起相應(yīng)蛋白無法合成，進(jìn)而影響感光細(xì)胞的發(fā)育或正常結(jié)構(gòu)與功能維持。而轉(zhuǎn)入相應(yīng)正?；騽t很有可能挽救因基因變異導(dǎo)致凋亡的感光細(xì)胞，甚至使其恢復(fù)正常水平。目前已有大量相關(guān)研究均成功地將正?；?qū)攵喾NRP動(dòng)物模型［2］。臨床實(shí)驗(yàn)也證明了其有效性和安全性［3］。然而常規(guī)基因治療的缺陷在于必須針對患者缺陷基因和患者自身?xiàng)l件選擇載體并設(shè)計(jì)治療方案，其效率底、成本高。

近年來隨著光感受蛋白的發(fā)現(xiàn)，一種新的基因治療概念被提出:將光感受蛋白基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入發(fā)生退行性變視網(wǎng)膜的神經(jīng)元中，使其直接對光照產(chǎn)生反應(yīng)，從而恢復(fù)視覺［4］。研究表明，將一種外源性光感受蛋白——視紫質(zhì)通道蛋白(channelrhodopsin-2，ChR2)基因定向轉(zhuǎn)染進(jìn)入視網(wǎng)膜變性模型rd1小鼠視網(wǎng)膜給光型雙極細(xì)胞，在較強(qiáng)光刺激下可以觀察到動(dòng)物視覺的恢復(fù)［5］。有研究者將光敏感度高的內(nèi)源性光感受蛋白黑視素(melanopsin/opsin 4，Opn4)表達(dá)至rd1小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，恢復(fù)了動(dòng)物部分視力［6］。而將黑視素基因轉(zhuǎn)導(dǎo)于節(jié)細(xì)胞上級神經(jīng)元(如雙極細(xì)胞)尚未見報(bào)道。

黑視素蛋白是一種內(nèi)源性光感受蛋白，約0.8%～1.0% 的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞含有黑視素［7］。黑視素參與晝夜節(jié)律［8］、瞳孔對光反射［9］等行為。黑視素蛋白不僅對光反應(yīng)迅速，也由于其內(nèi)源性的特點(diǎn)在體內(nèi)長期表達(dá)不會(huì)引起免疫負(fù)反應(yīng)。而將給光雙極細(xì)胞作為靶點(diǎn)可以使動(dòng)物區(qū)分給光/撤光通路，恢復(fù)較為高級視覺行為;此外給光雙極細(xì)胞內(nèi)部含有的多種G蛋白調(diào)節(jié)因子(regulators of G-protein signaling，RGS;如 RGS7和 RGS20)、浦肯野細(xì)胞蛋白 2(Purkinje cell protein 2，PCP2)等，均可參與加速細(xì)胞的光反應(yīng)［10］。因此，本研究將選取甲基亞硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)誘導(dǎo)的CD1小鼠作為視網(wǎng)膜色素變性模型，定向轉(zhuǎn)導(dǎo)黑視素基因于其視網(wǎng)膜給光型雙極細(xì)胞，以期恢復(fù)動(dòng)物視覺行為。

材料和方法

1 動(dòng)物

CD1小鼠購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號為SCXK粵，2008-0002)。2雌1雄配種合籠飼養(yǎng)，不限食水，飼養(yǎng)溫度保持在23～26℃，嚴(yán)格遵循12 h晝/夜節(jié)律，使用內(nèi)部空氣循環(huán)系統(tǒng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作過程嚴(yán)格遵從暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用條例。

2 主要材料

質(zhì)粒Grm6-Opn4-GFP和Grm6-GFP均由美國賓夕法尼亞大學(xué)神經(jīng)科學(xué)系視網(wǎng)膜研究室提供。構(gòu)建出的質(zhì)粒已通過基因測序檢測。其中Grm6為給光雙極細(xì)胞特異性受體——代謝型谷氨酸受體 6(metabotropic glutamate receptor 6，mGluR6)的啟動(dòng)子;Opn4為黑視素基因序列;GFP為綠色熒光蛋白基因序列。

MNU購于Sigma，實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水(normal saline，NS)配制為1% 溶液。由于MNU商品中含有少量醋酸，在終溶液中含量為 0.1%，故配制含有0.1% 醋酸的NS溶液作為對照組注射用液。

3 方法

3.1 MNU誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素變性模型的建立 取成年CD1小鼠，于腹腔注射1%MNU，60 mg/kg(體重)。于第7天處死動(dòng)物，取眼球制冰凍切片。切片經(jīng)DAPI染色顯示由MNU誘導(dǎo)7 d后小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞完全死亡，外核層消失，內(nèi)核層(雙極細(xì)胞、無長突細(xì)胞、水平細(xì)胞)及節(jié)細(xì)胞層完好，證明CD1小鼠腹腔注射MNU可形成迅速穩(wěn)定的視網(wǎng)膜色素變性模型，見圖1。

Figure 1.The retinal slices of normal(A)and MNU-induced CD1 mice at 7 d(B).The MNU-induced mouse lost the whole outer nuclear layer(ONL)，while the inner nuclear layer(INL)and retinal ganglion cell layer(GCL)remained，suggesting that MNU could induce a model of RP.PE:pigment epithelium.Scale bar=20 μm.圖1 正常和MNU誘導(dǎo)7 d的CD1小鼠的視網(wǎng)膜切片

3.2 乳鼠眼底注射質(zhì)粒并電轉(zhuǎn) 用生理鹽水將目的質(zhì)粒稀釋至3 g/L，加入0.1%Fast green染料。Fast green是一種安全無毒的深綠色染色劑，用于評價(jià)眼底注射手術(shù)情況。取P0～P1乳鼠，隨機(jī)分為治療組(Grm6-Opn4-GFP)和陰性對照組(Grm6-GFP)。在手術(shù)顯微鏡下用注射器針頭(0.5 mL)劃開動(dòng)物右眼眼瞼并突出眼球，于眼球鼻側(cè)角鞏緣下方開口。微量注射器針尖由此開口進(jìn)入眼球，迅速將0.5 μL質(zhì)粒溶液注入乳鼠視網(wǎng)膜下腔。術(shù)后乳鼠立刻利用電轉(zhuǎn)電融合儀(BEX-CUY21VIVO-SQ)進(jìn)行眼部電轉(zhuǎn)，手術(shù)眼為正極，對照眼為負(fù)極。電轉(zhuǎn)參數(shù)設(shè)置:電壓80 V，刺激時(shí)長50 ms，間隔時(shí)間950 ms，連續(xù)刺激5次。

3.3 行為學(xué)檢測 動(dòng)物行為學(xué)檢測采用明暗箱測試，規(guī)格為16×16×25+16×16×25(長×寬×高;單位:cm)，箱體間有門可供動(dòng)物自由穿梭。2個(gè)箱頂均設(shè)有攝像頭對動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行追蹤，并由動(dòng)物行為軌跡分析系統(tǒng)(Noldus-EthoVision XT 7.0)進(jìn)行分析。測試時(shí)長為5 min。共設(shè)計(jì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組:正常對照組(normal)、生理鹽水Grm6-Opn4-GFP對照組(NS+melanopsin)、MNU誘導(dǎo)模型 Grm6-Opn4-GFP治療組(MNU+melanopsin)、MNU誘導(dǎo)模型Grm6-GFP對照組(MNU+GFP)和 MNU誘導(dǎo)組(MNU)。誘導(dǎo)后連續(xù)7 d進(jìn)行明暗箱測試。記錄動(dòng)物在儀器中運(yùn)動(dòng)軌跡，并計(jì)算第7天動(dòng)物在暗箱中活動(dòng)時(shí)間占總時(shí)長的百分比。

3.4 電眼生理系統(tǒng)檢測ERG 動(dòng)物于全暗條件下進(jìn)行12 h暗適應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前6 h禁食禁水。檢測前于暗紅燈光下用3.5%水合氯醛對動(dòng)物進(jìn)行麻醉(12.5 μL/g體重)。待動(dòng)物全麻后于其雙眼眼表滴加復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳。將動(dòng)物放于活動(dòng)搭載臺上并連接電極?；顒?dòng)電極采用3 mm環(huán)形角膜接觸電極，參考電極為不銹鋼針電極，插于雙耳耳后皮下，接地電極插于尾根皮下。散瞳完畢，于動(dòng)物雙眼各滴加10 g/L甲基纖維素溶液，可降低阻抗，保持眼球濕潤。待參考電極阻抗穩(wěn)定在2.3 kΩ以下，活動(dòng)電極阻抗保持在7 kΩ以下，關(guān)閉所有光源給予動(dòng)物5 min暗適應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中給予 Scotopic 0.003、0.03、0.3、1、3和10 cd·s/m2一系列刺激，經(jīng)5 min強(qiáng)度為20 cd/m2的綠色背景光明適應(yīng)后，再給予Photopic 0.3、1、3、10 和30 cd·s/m2刺激。刺激強(qiáng)度不高于 3.0 cd·s/m2時(shí)刺激光均為綠光，高于3.0 cd·s/m2時(shí)則為白光。刺激次數(shù)及間隔時(shí)間根據(jù)刺激光強(qiáng)分別為3～10次和2～10 s之間。用Clampfit 9.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。從測試系統(tǒng)導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)后，濾去50 Hz波，測量計(jì)算波形中主要反映給光雙極細(xì)胞光反應(yīng)的b波振幅及潛伏期并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果的鑒定 取不低于5周齡的動(dòng)物，用3.5%水合氯醛腹腔過量注射對其進(jìn)行麻醉(20 μL/g)處死后全身灌流。待動(dòng)物全身僵直灌注成功后，取出其右眼眼球，置于4%多聚甲醛中固定30 min。隨后剝離視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜平鋪片，在熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白的表達(dá)并拍照。用共聚焦顯微鏡對轉(zhuǎn)染成功的視網(wǎng)膜平鋪片拍照并進(jìn)行三維重建。40倍油鏡，光切厚度為1.5 μm。重建時(shí)統(tǒng)一將立體圖像沿Z軸旋轉(zhuǎn)，通過雙極細(xì)胞特有形態(tài)辨認(rèn)轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。最后進(jìn)行黑視素抗體免疫熒光檢驗(yàn)并將視網(wǎng)膜進(jìn)行震動(dòng)切片(50 μm)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，單因素分析檢驗(yàn)組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黑視素可以定向表達(dá)于給光雙極細(xì)胞

1.1 質(zhì)粒定向轉(zhuǎn)染進(jìn)入給光型雙極細(xì)胞 正常小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育在5周時(shí)達(dá)到成熟，故選擇5周以上的小鼠能夠準(zhǔn)確地反映視網(wǎng)膜發(fā)育、變性以及目的基因治療的狀況。首先取小鼠經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的右眼視網(wǎng)膜進(jìn)行平鋪片，在熒光顯微鏡下觀察。觀察到視網(wǎng)膜局部存在密集綠色熒光蛋白即可初步認(rèn)定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，見圖2A、B。將平鋪片共聚焦斷層掃描結(jié)果經(jīng)Z軸旋轉(zhuǎn)可清晰看到所有被綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞都具有典型的給光型雙極細(xì)胞形態(tài)，包括胞體兩側(cè)的樹突、軸突以及分支在給光層的軸突末端，見圖2C、D。

1.2 轉(zhuǎn)染Grm6-Opn4-GFP的細(xì)胞表達(dá)黑視素蛋白

隨后進(jìn)行視網(wǎng)膜平鋪片的黑視素抗體免疫熒光染色，以檢驗(yàn)黑視素蛋白的表達(dá)。視網(wǎng)膜平鋪片顯示所有被綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞都被黑視素抗體標(biāo)記;對照質(zhì)粒Grm6-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未被黑視素抗體標(biāo)記，見圖3。因此，電轉(zhuǎn)染技術(shù)可以使黑視素蛋白特異地表達(dá)于給光型雙極細(xì)胞。

Figure 2.Grm6-Opn4-GFP plasmid was specifically transfected into ON-bipolar cells.A:the whole-mount retina showing successful transfection;B:enlarged image of the box region in A;C:confocal microscopy of the transfected region;D:the 3D reconstruction in Z axis.The solid arrows show the dendrites of the bipolar cells and the dotted arrow shows the axon of the bipolar cells.The solid lines in D show the inner plexiform layer(IPL)of retina，and the dashed line divides the ON and OFF sublayers.All transfected bipolar cells have axon terminals in the ON sublayer.Scale bars:200 μm(A)，20 μm(B)and 100 μm(C，D).圖2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率檢查表明質(zhì)粒能夠定向表達(dá)于給光型雙極細(xì)胞

Figure 3.Anti-melanopsin test on whole-mount retina(MNU-induced)transfected with Grm6-Opn4-GFP and Grm6-GFP plasmids.圖3 Grm6-Opn4-GFP和Grm6-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的小鼠視網(wǎng)膜平鋪片上黑視素蛋白的表達(dá)

2 行為學(xué)檢測(明暗箱測試)表明黑視素治療小鼠的趨暗視覺行為有所恢復(fù)

小鼠為夜行性哺乳動(dòng)物，其活動(dòng)具有趨小、趨暗的特點(diǎn)。視覺能力正常的小鼠在除光亮度外其余條件均一致的明暗箱中自由活動(dòng)時(shí)，對暗箱表現(xiàn)出明顯的趨向性，見圖4C;而完全失明的小鼠由于無法區(qū)分明暗，不表現(xiàn)出任何趨向性。因此，通過比較小鼠在暗箱的活動(dòng)時(shí)間比，可以作為檢測小鼠視覺行為的手段。MNU誘導(dǎo)的CD1模型組動(dòng)物連續(xù)7 d的測試顯示，經(jīng)MNU誘導(dǎo)的小鼠視覺行為能力在注射后7 d內(nèi)迅速下降，于7 d呈完全失明狀態(tài)，這點(diǎn)與7 d后視網(wǎng)膜感光細(xì)胞完全消失相對應(yīng)，見圖4D。而經(jīng)Grm6-Opn4-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的MNU模型小鼠則表現(xiàn)出一定程度的恢復(fù)趨勢，在黑箱的活動(dòng)時(shí)間顯著長于未治療組(P＜0.05)，見圖4B、E;但未能達(dá)到正常組和生理鹽水對照組水平(P＜0.05)，見圖4A、C。這表明黑視素蛋白表達(dá)可以提高動(dòng)物的基本視覺能力。

3 電眼生理系統(tǒng)檢測表明黑視素治療小鼠的ERG b波有所恢復(fù)

閃光視網(wǎng)膜電圖(flash ERG)波形主體通常由1個(gè)向下的負(fù)波和緊隨其后1個(gè)向上的正波構(gòu)成。向下的負(fù)波被稱為a波，其振幅及潛伏期反映了感光細(xì)胞的光反應(yīng)情況;a波之后迅速向上的正波被稱為b波，反映的是給光型雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞的光反應(yīng)，也是本文重點(diǎn)關(guān)注的部分。在明適應(yīng)條件下，b波之后還可能會(huì)出現(xiàn)一個(gè)向下的負(fù)波，被稱為明視負(fù)波反應(yīng)(photopic negative response，PhNR)，主要反映神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的光反應(yīng)。正常小鼠感光細(xì)胞正常，flash ERG測試可以獲得清晰的a波、b波和PhNR，見圖5A。然而視網(wǎng)膜色素變性由于其感光細(xì)胞受損，將無法檢測到任何波型。本實(shí)驗(yàn)預(yù)期受質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并表達(dá)黑視素蛋白的給光型雙極細(xì)胞可以直接對光產(chǎn)生反應(yīng)后形成電信號，恢復(fù)b波，進(jìn)而將信號傳導(dǎo)至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，恢復(fù)PhNR。

Figure 4.Transfecting melanopsin partially restored the visual behavior of MNU-induced retinitis pigmentosa mice.The running traces of CD1 mice in dark zones(left)and light zones(right)were shown.Mean±SEM.n≥10.☆P ＜0.05，☆☆P ＜ 0.01 vs NS+melanopsin control;★P ＜0.05 vs MNU group or MNU+GFP group.圖4 轉(zhuǎn)染黑視素基因可以使MNU誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素變性小鼠恢復(fù)部分視力

視網(wǎng)膜電圖測試顯示，隨著閃光強(qiáng)度的增加，正常小鼠的a、b波幅度增強(qiáng)，潛伏期縮短;MNU誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性的小鼠ERG波形完全消失;經(jīng)Grm6-Opn4-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MNU誘導(dǎo)的CD1小鼠在閃光刺激強(qiáng)度增高至1 cd·s/m2時(shí)，b波有局部恢復(fù)，見圖5B。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明，治療組b波振幅與未治療組相比有顯著差異(P＜0.01)，表明動(dòng)物視覺反應(yīng)得到了一定恢復(fù)，但尚未能達(dá)到正常水平(約正常水平的10%)，其潛伏期也有所推遲，見圖5C、D。但是，在明適應(yīng)條件下，治療組未發(fā)現(xiàn)具有b波恢復(fù)的趨勢，也未觀察到反應(yīng)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的PhNR。

討 論

本實(shí)驗(yàn)利用給光型雙極細(xì)胞特異性受體mGluR6編碼序列作為啟動(dòng)子，下游接目的基因黑視素及用于標(biāo)記的綠色熒光蛋白序列，利用在體電轉(zhuǎn)技術(shù)，使黑視素和綠色熒光蛋白在給光雙極細(xì)胞中定向表達(dá)。電轉(zhuǎn)技術(shù)是一項(xiàng)廣泛應(yīng)用的分子生物技術(shù)，其作用是將外源物質(zhì)如藥物、小片段DNA等轉(zhuǎn)入目的受體中，病毒、真菌、離體培養(yǎng)的細(xì)胞和組織、在體動(dòng)物細(xì)胞均可作為受體，具有高效、穩(wěn)定等特點(diǎn)。

MNU屬于亞硝酰胺類亞硝基化合物，是一種廣泛分布于環(huán)境中的強(qiáng)烷化劑，對動(dòng)植物具有強(qiáng)有力的致突變、致畸形和致癌作用。單次腹腔注射一定劑量MNU可迅速誘導(dǎo)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)理是MNU對感光細(xì)胞DNA產(chǎn)生烷化作用，生成7-甲基脫氧尿苷DNA嵌合物［11］，從而破壞 DNA的結(jié)構(gòu)，引起視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的不可逆性凋亡。該過程伴有 Bcl-2下調(diào)、Bax上調(diào)［12］和 caspase-3、－6、－8通路的激活。此外，MNU誘導(dǎo)的RP模型適用于成年小鼠和大鼠，可重復(fù)性高，1周之內(nèi)即可形成穩(wěn)定的RP模型，在RP的實(shí)驗(yàn)研究中得到廣泛應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功的將目的基因通過質(zhì)粒載體利用電轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)至MNU誘導(dǎo)的RP動(dòng)物視網(wǎng)膜神經(jīng)元中，并在給光雙極細(xì)胞中定向表達(dá)。ERG測試顯示經(jīng)Grm6-Opn4-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的RP模型組在1～10 cd·s/m2光強(qiáng)部分恢復(fù)了b波，說明被轉(zhuǎn)導(dǎo)的給光雙極細(xì)胞能直接對光產(chǎn)生反應(yīng)。明暗箱測試顯示動(dòng)物行為能力有明顯恢復(fù)說明給光雙極細(xì)胞將光反應(yīng)信號轉(zhuǎn)化為電信號，并通過視網(wǎng)膜神經(jīng)元回路對信號進(jìn)行加工，傳遞至視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，信號在節(jié)細(xì)胞處形成動(dòng)作電位，經(jīng)視神經(jīng)傳遞至視皮層形成視覺，促使動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的趨暗特性。

Figure 5.Transfecting melanopsin partially restored ERG responses in retinitis pigmentosa mice.A:a-wave，b-wave and PhNR of ERG responses in a normal mouse;B:the scotopic ERG waves in CD1 mice of various groups in response to flashes at increasing intensity;C:the amplitude of b-wave in CD1 mice of various groups;D:the latency of b-wave in CD1 mice of various groups.Mean ±SEM.n≥10.＊＊P ＜0.01 vs MNU group or MNU+GFP group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs NS+melanopsin group.圖5 黑視素基因轉(zhuǎn)染的視網(wǎng)膜色素變性小鼠ERG測試中b波有部分恢復(fù)

ERG測試中，經(jīng)Grm6-Opn4-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的模型組沒有記錄到反應(yīng)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞光反應(yīng)活動(dòng)的PhNR?，F(xiàn)分析原因如下:雙極細(xì)胞根據(jù)與視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞的聯(lián)系分為視桿－雙極細(xì)胞和視錐－雙極細(xì)胞。視桿－雙極細(xì)胞均為給光型，大約占全部給光型雙極細(xì)胞的43%［13］;視錐－雙極細(xì)胞在小鼠視網(wǎng)膜中共有9種亞型，而其中的5種為給光型［14］。即給光型雙極細(xì)胞由全部的視桿－雙極細(xì)胞和部分視錐－雙極細(xì)胞構(gòu)成。在明適應(yīng)條件下，動(dòng)物的視覺行為是由視錐細(xì)胞來完成的，相應(yīng)的視錐－雙極細(xì)胞對明適應(yīng)視覺行為的參與應(yīng)該多過于視桿－雙極細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞更多地接收來自視錐－雙極細(xì)胞發(fā)出的信號。如果視桿－雙極細(xì)胞的活動(dòng)受到抑制，則發(fā)揮作用的給光型雙極細(xì)胞數(shù)量會(huì)明顯減小。由此可見，本實(shí)驗(yàn)中治療模型組動(dòng)物在明適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖中未能表現(xiàn)出b波的恢復(fù)以及明視負(fù)波的反應(yīng)，可能由于明適應(yīng)條件下，轉(zhuǎn)染成功的視桿－雙極細(xì)胞受到了一定程度的抑制，從而減弱了整體轉(zhuǎn)染成功的雙極細(xì)胞的活動(dòng)，進(jìn)而影響下一級神經(jīng)元神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的活動(dòng)。

總而言之，利用電轉(zhuǎn)染法，以給光雙極細(xì)胞特異性受體mGluR6作為啟動(dòng)子，可以將內(nèi)源性光感受蛋白黑視素基因定向轉(zhuǎn)染至視網(wǎng)膜給光雙極細(xì)胞中表達(dá)并恢復(fù)視網(wǎng)膜色素變性模型動(dòng)物的部分視力。

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