葉吉云 李洱花 劉云霞 田大廣 高波★

2.昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院肝膽外科，云南，昆明 650101

末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）以分子生物學(xué)的手段，以微生物自身組成成分中的“家族特異性保守物質(zhì)”（例如，DNA/RNA等）的分子進(jìn)化史等為主要工作對(duì)象來(lái)研究微生物的群落生態(tài)[1]，對(duì)微生物的檢測(cè)不受微生物的狀態(tài)和培養(yǎng)手段的限制[2]，是目前被廣泛采用的DNA指紋印記分析的一種方法。在國(guó)內(nèi)，對(duì)于分子微生物生態(tài)學(xué)的研究也是剛剛起步。本文為進(jìn)一步探討細(xì)菌群落與膽囊結(jié)石的發(fā)病機(jī)理之間的關(guān)系，采用T-RFLP技術(shù)對(duì)膽囊結(jié)石微生物群落16S rDNA基因序列進(jìn)行分析研究。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

取自2007年2月～2007年6月在昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院接受擇期膽囊切除術(shù)的膽囊結(jié)石患者，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)無(wú)急性膽道感染癥狀，HBsAg陰性。完成腹腔鏡膽囊切除術(shù)，無(wú)菌注射器穿刺取膽汁3 mL～5 mL置于無(wú)菌試管內(nèi)，同時(shí)收集膽囊結(jié)石，記錄其大小、數(shù)目，用生理鹽水沖洗干凈。標(biāo)本放在無(wú)菌容器內(nèi)-20℃保存。依據(jù)紅外吸收光譜法測(cè)定膽固醇含量純膽固醇結(jié)石（CS）：膽固醇含量≥90%，納入本研究。膽汁細(xì)菌常規(guī)和厭氧培養(yǎng)陽(yáng)性的病例被剔除。本組8例中男3例，女5例，年齡25～73歲，平均年齡55歲。診斷經(jīng)病理證實(shí)。

1.2 微生物群落DNA 提取方法

1.2.1 結(jié)石微生物群落DNA提取

干燥至恒重后取150 mg結(jié)石粉末，加入 1% SDS 700μL在5 mL聚丙烯試管內(nèi)，室溫培養(yǎng)過夜。加入LiCl（7 mol/L），最終濃度為1.5 mol/L。靜置15 min，震蕩 1 min，離心（12 000 rpm，15 min）；取上清液至一滅菌塑料離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液抽提2次，取上清液，加1/10體積3 mol/L醋酸鈉。再加無(wú)水乙醇（終體積比80%），-70℃靜置2 h，將上部所得溶液全部倒入收集管內(nèi)的吸附柱中，12 000 rpm離心5 min，將柱放入干凈EP管中，加30～50μL TE緩沖溶液（含RNA酶）充分溶解DNA。靜置1 min，12 000 rpm離心2 min，洗脫液為提取到的DNA，-20℃保存。

1.2.2 膽汁微生物群落DNA提取

對(duì)文獻(xiàn)[3]介紹的DNA 提取方法進(jìn)行適當(dāng)修改后作為本研究的DNA 提取方法。取膽汁混合樣10 mL，用聚碳酸酯膜（0.22μm，47 mm，北京華美公司）進(jìn)行真空抽濾（-0.1 MPa），待水樣抽干后，將濾膜取下，用無(wú)菌剪刀剪成小塊，放入10 mL無(wú)菌離心管；加入1 mL Buffer I（0.15 mol/L NaCl，0.1 mol/L Na2EDTA，pH8），渦旋振蕩，使buffer I與膜充分接觸；加入100μL溶菌酶（50 g/L），溫育1 h（37℃）；將離心管放入液氮中5 min 后迅速移至65℃水浴鍋中解凍3 min，這樣反復(fù)凍融3次；加入0.5 mL buffer II（0.1 mol/L NaCl，0.5 mol/L Tris-HCl，10%SDS，pH8），上下?lián)u勻，加入5μL蛋白酶K（20 g/L），水浴1 h（55℃）；依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法[4]進(jìn)行酚仿抽提2次，取上清轉(zhuǎn)移至新的10 mL離心管中；加入2倍體積無(wú)水冰乙醇沉淀DNA，-20℃過夜，離心（13 000 rpm，30 min）；棄去上清，加入1 mL 70%乙醇，離心（13 000 rpm，15 min），棄上清；干燥后，加入30～50μL TE 緩沖溶液充分溶解DNA。

1.3 膽汁、結(jié)石細(xì)菌16S rDNA 基因擴(kuò)增

對(duì)樣品DNA進(jìn)行適當(dāng)稀釋之后，進(jìn)行細(xì)菌的16S rDNA的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積50μL：（1）10×buffer：5μL；（2） 4×dNTP：4μL（2.5 mM）；（3）MgCl2：3μL（25 mM）；（4）8F-FAM：1μL（10 pmol/μL）；（5）1492R：1μL（10 pmol/μL）；（6）Taq 酶：0.3μL（TaKaRa，5 U/μL）；（7）滅菌水：33.7μL；（8）DNA模板：2μL。熱循環(huán)條件預(yù)變性：94℃，5 min；變性：94℃，1 min；退火：51℃，1 min；延伸：72℃，1.5 min；30個(gè)循環(huán)；4℃保存PCR產(chǎn)物。細(xì)菌的擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用引物8F（5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）和 1492R（5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'），在引物8F的5'端標(biāo)記熒光物質(zhì)（6-FAM）。用于構(gòu)建克隆文庫(kù)的PCR則采用不帶熒光標(biāo)記的引物。PCR產(chǎn)物利用ChargeSwitch純化試劑盒（Invitrogen，USA）進(jìn)行純化。

1.4 T-RFLP分析

對(duì)細(xì)菌16S rDNA的PCR純化產(chǎn)物分別用TaqI、65℃酶切 3 h 和 RsaI、37℃酶切 3 h；酶切產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽后[5]，用甲酰胺進(jìn)行溶解；取3～5 μL酶切產(chǎn)物至10μL甲酰胺中，并加入0.2μL 內(nèi)標(biāo)Liz500（Applied Biosystems Incorporated，USA）；將該混合物在95℃變性5 min，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰上，取10μL至96孔板中，在ABI 3130遺傳分析儀中進(jìn)行毛細(xì)管電泳；取熒光強(qiáng)度50RFU為基線，用Genemapper軟件（Applied Biosystems Incorporated，USA）計(jì)算大于基線的峰高和出峰處的末端標(biāo)記限制性片段（Terminal Restriction Fragment，T-RF）長(zhǎng)度；將T-RF大于50 bp的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[6]，計(jì)算相對(duì)應(yīng)的豐度。

1.5 克隆文庫(kù)的構(gòu)建、測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用非熒光標(biāo)記的引物對(duì)細(xì)菌的16S rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用pGEM-T easy載體（Promega，USA）和E.coli DH5α菌株建立細(xì)菌的16S rDNA文庫(kù)。利用PCR-T-RFLP分析對(duì)細(xì)菌克隆文庫(kù)中隨機(jī)挑選的46個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行分型篩選，挑選代表克隆進(jìn)行測(cè)序（北方諾塞基因公司），獲得細(xì)菌的16S rDNA部分序列。對(duì)這些序列利用Blast分析與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）。

2 結(jié)果

2.1 膽汁、結(jié)石微生物群落DNA檢出率

膽汁標(biāo)本均未提取到膽汁細(xì)菌總DNA。結(jié)石標(biāo)本中，純膽固醇組細(xì)菌16S rDNA陽(yáng)性率為37.5%（3/8）。

2.2 純膽固醇組膽囊結(jié)石T-RFLP圖譜分析

純膽固醇組中有3例標(biāo)本經(jīng)PCR獲得細(xì)菌16S rDNA，分別標(biāo)為 L1、L2、L3通過對(duì)其在 ABI 3130遺傳分析儀中進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用Genemapper軟件計(jì)算大于基線的峰高和出峰處的T-RF長(zhǎng)度得到T-RFLP 圖譜（圖 1、2、3）。

根據(jù)T-RF不同，挑選相應(yīng)的克隆測(cè)序，結(jié)果表明，純膽固醇結(jié)石中細(xì)菌主要為Enterobacteriaceae和Mircrococcaceae的微生物，其中克隆D13、D12、E13（T-RF 422 bp）分 布 在Enterobacteriaceae的Escherichia屬，T-RF同為422 bp的E9則分布在Enterobacteriaceae的Salmonella屬；克隆F4（T-RF 394 bp）為Enterobacteriaceae的Klebsiella屬，克隆D10、G7、D8（T-RF 394 bp）則分布在Mircrococcaceae的Staphylococcus屬。

T-RF同為422 bp的D15克隆則可能是屬于新的微生物物種，因?yàn)槟壳霸贕enebank中尚未找到與其16S rDNA序列相似的細(xì)菌序列。（表1）。

圖1 樣品L1的細(xì)菌群落T-RFLP圖譜Figure 1 T-RFLP diagram of sample L1

圖2 樣品L2的細(xì)菌群落T-RFLP圖譜Figure 2 T-RFLP diagram of sample L2

圖3 樣品L3的細(xì)菌群落T-RFLP圖譜Figure 3 T-RFLP diagram of sample L3

表1 純膽固醇結(jié)石中主要優(yōu)勢(shì)T-RF細(xì)菌克隆序列比對(duì)結(jié)果Table 1 Comparison of the clone seguence of T-RF bacteria in cholesterol stone

3 討論

1995年Swidsinski[7]用NT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)在常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)陰性的膽固醇結(jié)石中有較高的細(xì)菌DNA檢出率，才將細(xì)菌感染引入到膽囊結(jié)石的研究中，由于方法學(xué)的限制，人們對(duì)引起膽囊結(jié)石的微生物認(rèn)識(shí)有限，特別是對(duì)膽固醇含量超過90%的純膽固醇結(jié)石與細(xì)菌感染的關(guān)系更是知之甚少。

分子微生物生態(tài)學(xué)就是運(yùn)用分子生物學(xué)的方法和技術(shù)，在基因水平上估計(jì)種的個(gè)體豐度，查明種的變異情況以及探究群落中微生物間相互關(guān)系的科學(xué)。生物技術(shù)的應(yīng)用，使我們不必培養(yǎng)微生物，而直接通過對(duì)環(huán)境中遺傳物質(zhì)的研究來(lái)達(dá)到目的，它為微生物生態(tài)學(xué)的研究開辟了新的途徑，T-RFLP又被稱為16S rDNA 基因的 T-RF分析技術(shù)，是一種新興研究微生物多態(tài)性的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)已被成功地應(yīng)用到了各種微生物群落的比較分析、微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)特征等方面。T-RFLP是根據(jù)16S rDNA的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，對(duì)上游引物的5'端用熒光物質(zhì)6-FAM標(biāo)記，然后選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化，再經(jīng)毛細(xì)管電泳就可建立各細(xì)菌菌株特有的峰譜。本法能夠檢測(cè)難以培養(yǎng)的各種細(xì)菌。由于只有5'末端有標(biāo)記，因此用GeneScan基因掃描儀只能測(cè)定5'末端帶有熒光標(biāo)記的限制性片段，從而克服了產(chǎn)生大量酶切片段的問題。利用T-RFLP方法分析16S rDNA片斷中高度保守的家族特異性序列的種類、數(shù)量和相對(duì)豐度就可以了解樣品中各種微生物的種類，種群數(shù)量和相對(duì)組成，從而比較準(zhǔn)確、全面和客觀地了解該環(huán)境中微生物群落的組成。其主要優(yōu)勢(shì)不僅避免了傳統(tǒng)微生物富集培養(yǎng)的高度選擇性、繁雜費(fèi)時(shí)等限制，還可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的并行分析，速度快，信息量大，而且準(zhǔn)確全面，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化及互聯(lián)網(wǎng)海量數(shù)據(jù)共享，從而探明微生物生態(tài)系統(tǒng)的功能和微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，有助于疾病分析及治療。

本研究以利用T-RFLP技術(shù)對(duì)純膽固醇結(jié)石細(xì)菌微生物群落16S rDNA基因序列進(jìn)行分析，研究表明在膽汁中并未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌16S rDNA存在的證據(jù)，而在結(jié)石中卻有豐富的細(xì)菌16S rDNA。根據(jù)既往研究結(jié)果，我們認(rèn)為即使膽汁中能夠發(fā)現(xiàn)細(xì)菌16S rDNA存在的證據(jù)也僅能反映膽囊切除時(shí)細(xì)菌感染的情況，而結(jié)石中的細(xì)菌檢出率則反映的是結(jié)石形成和生長(zhǎng)過程中細(xì)菌感染的狀況，二者在時(shí)間上無(wú)可比性。本研究也顯示，在膽汁中無(wú)細(xì)菌16S rDNA存在的樣本中，結(jié)石卻能發(fā)現(xiàn)細(xì)菌16S rDNA，二者并無(wú)明顯的聯(lián)系。

研究表明純膽固醇結(jié)石細(xì)菌16S rDNA陽(yáng)性率為37.5%（3/8），T-RF主要為394 bp和422 bp。經(jīng)克隆測(cè)序表明，細(xì)菌群落主要為腸桿菌（Enterobacteriaceae）和微球菌科（Mircrococcaceae）的微生物，這與已知的腸道菌群有較高的相似性，由此推斷定植于腸道的正常菌群或條件致病菌細(xì)菌在某種因素的影響下可以突破機(jī)體的防御系統(tǒng)通過Oddi氏括約肌進(jìn)入膽道到達(dá)膽囊定植，通過細(xì)菌本身和/或其代謝產(chǎn)物參與膽囊結(jié)石的形成。細(xì)菌群落在屬水平涉及埃希氏菌屬（Escherichia），沙門氏菌屬（Salmonella），克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和葡萄球菌屬（Staphlococcus），這些微生物群落在較高的分類學(xué)水平（例如科）的群落多樣性并不很高，而在屬水平表現(xiàn)出了不同的多樣性，可能是由于膽囊對(duì)膽汁的濃縮功能，膽汁中含有一些物質(zhì)，如膽汁酸鹽、膽固醇和微量元素，可作為電子受體或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)支持細(xì)菌生長(zhǎng)代謝，并使結(jié)石細(xì)菌群落表現(xiàn)出多樣性。同時(shí)也應(yīng)看出，有一定的未培養(yǎng)微生物（Uncultured bacterium clone）檢出其多樣性尚未納入研究，對(duì)這類目前尚未培養(yǎng)的未知細(xì)菌的功能特性和生命活動(dòng)規(guī)律的了解、還需更加深入的研究。

特別指出在本研究中檢測(cè)到腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的沙門氏菌屬（Salmonella）。在體外研究發(fā)現(xiàn)，Salmonella能夠形成生物被膜，抵御膽鹽的侵襲，通過生物被膜與其他定植于膽囊的細(xì)菌相連接，共同構(gòu)成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)菌群落，將其生物被膜不斷擴(kuò)展以保護(hù)整個(gè)群落不受外界物質(zhì)侵襲，而膽汁恰恰是生物被膜形成的最佳刺激信號(hào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Salmonella首先要在結(jié)石表面定植才能形成被膜，而且成膜時(shí)間平均為10～14天，而其他能夠成膜的細(xì)菌平均成膜時(shí)間為幾秒鐘至幾小時(shí)不等。但在體內(nèi)由于膽囊內(nèi)環(huán)境極為復(fù)雜，膽囊的排空功能在體外難以模擬，Salmonella能否也能形成生物被膜有待證實(shí)。

T-RFLP也有一定的局限性：（1）T-RFLP 是基于PCR 擴(kuò)增的技術(shù)，因此就擺脫不了這類技術(shù)共同的缺陷；（2）該指紋印記技術(shù)只檢測(cè)帶熒光標(biāo)記的末端限制性片段，造成對(duì)群落多樣性的低估；（3）酶切后T-RF 的長(zhǎng)度分布也會(huì)造成對(duì)復(fù)雜群落多樣性的低估。因?yàn)闇y(cè)序儀檢測(cè)500 bp以上的T-RF精度不夠[8]；（4）實(shí)驗(yàn)過程影響因素眾多，使得T-RFLP圖譜的解析存在一定的不確定性。比如DNA提取方法、PCR中的參數(shù)設(shè)置及限制性內(nèi)切酶等的選擇都可能直接對(duì)最終的T-RFLP圖譜產(chǎn)生影響。本研究?jī)H為初步探討，具體細(xì)節(jié)還有待進(jìn)行更廣泛而深入的研究。

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