孟翠翠，羅治彬

胃癌是世界范圍內(nèi)死亡率居第二位的惡性腫瘤，5年生存率不足25%[1-2]。化療在胃癌治療中占有重要地位。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌的主要轉(zhuǎn)移途徑，而淋巴管生成可促進(jìn)腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)是最先發(fā)現(xiàn)的淋巴管生成因子，可以促進(jìn)腫瘤的淋巴管生成。環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一種新近發(fā)現(xiàn)的淋巴管生成因子，在頭頸部鱗癌[3]、乳腺癌[4]中可通過(guò)上調(diào)VEGF-C的表達(dá)促進(jìn)腫瘤淋巴管生成。塞來(lái)昔布是一種高選擇性COX-2抑制劑，在乳腺癌裸鼠移植瘤模型中可抑制腫瘤生長(zhǎng)及淋巴管生成[5]。Ran等[6]提出聯(lián)合使用化療和抗腫瘤淋巴管生成治療或許能夠有效抑制受損淋巴系統(tǒng)的重構(gòu)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。塞來(lái)昔布、塞來(lái)昔布聯(lián)合替吉奧對(duì)胃癌裸鼠皮下移植瘤淋巴管生成的影響國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，給予塞來(lái)昔布、替吉奧進(jìn)行干預(yù)，觀察塞來(lái)昔布單藥及聯(lián)合給藥的腫瘤治療作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 人胃癌SGC-7901細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心保存。4～6周齡BALB/c雌性裸鼠31只，購(gòu)于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2009-0004。裸鼠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)環(huán)境中，自由進(jìn)食水。塞來(lái)昔布購(gòu)自輝瑞制藥公司(美國(guó))，替吉奧購(gòu)自江蘇恒瑞制藥公司。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司(美國(guó))。兔抗COX-2抗體購(gòu)自Bioworld公司(美國(guó))，兔抗VEGF-C抗體購(gòu)自Epitomics公司(美國(guó))，敘利亞倉(cāng)鼠抗小鼠Podoplanin(腎小球足突細(xì)胞膜蛋白)抗體購(gòu)自Biolegend公司(美國(guó))，生物素標(biāo)記的羊抗敘利亞倉(cāng)鼠抗體購(gòu)自Bethyl公司(美國(guó))。免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑購(gòu)于北京中杉金橋生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分組干預(yù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后離心并計(jì)數(shù)，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/ml，每只裸鼠于背部靠近前肢部位接種2×106個(gè)細(xì)胞，共接種31只。腫瘤最大徑達(dá)5mm時(shí)開始分組干預(yù)。成瘤裸鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、替吉奧組、塞來(lái)昔布聯(lián)合替吉奧組(聯(lián)合給藥組，n=6)。塞來(lái)昔布、替吉奧均混懸于0.5%的羧甲基纖維素鈉中灌胃給藥。塞來(lái)昔布給藥劑量為50mg/(kg·d)，每只裸鼠給予0.2ml，每周連續(xù)給藥7d；替吉奧給藥劑量為10mg/(kg·d)，每只裸鼠給予0.1ml，每周連續(xù)給藥5d；聯(lián)合給藥組為上述劑量塞來(lái)昔布、替吉奧的聯(lián)合；陰性對(duì)照組給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。治療過(guò)程中注意觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)、大小便情況，測(cè)量給藥前后裸鼠體重變化，評(píng)價(jià)藥物治療的毒副作用。連續(xù)給藥3周后頸椎脫臼處死裸鼠，取材。測(cè)量瘤重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(1－干預(yù)組腫瘤重量/對(duì)照組腫瘤重量)×100%。

1.2.3 各組COX-2、VEGF-C的表達(dá)及淋巴管密度(LVD)計(jì)數(shù) 取腫瘤組織，采用免疫組化SP法檢測(cè)COX-2、VEGF-C的表達(dá)情況。枸櫞酸鹽抗原熱修復(fù)，3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，山羊血清封閉，分別滴加兔抗COX-2抗體(1:200)、兔抗VEGF-C抗體(1:100)、敘利亞倉(cāng)鼠抗小鼠Podoplanin抗體(1:200)，4℃冰箱過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液，一抗為Podoplanin時(shí)滴加生物素標(biāo)記的羊抗敘利亞倉(cāng)鼠二抗(1:50)，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉親和素，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，碳酸鋰返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下拍照。陽(yáng)性結(jié)果的判斷及計(jì)算：COX-2、VEGF-C陽(yáng)性染色定位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，為棕黃色染色。每張切片在200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量各組腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值。

淋巴管密度計(jì)數(shù)：以Podoplanin標(biāo)記淋巴管，陽(yáng)性染色定位于淋巴內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)，為棕黃色染色。以棕黃色染色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞簇或者結(jié)構(gòu)不相連的單個(gè)淋巴管作為一個(gè)淋巴管進(jìn)行計(jì)數(shù)，每張切片先在低倍鏡(×40倍)下找到淋巴管密集區(qū)域即熱點(diǎn)區(qū)，然后在高倍鏡(×200倍)下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)的淋巴管數(shù)，計(jì)算平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，治療前后裸鼠體重比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠移植瘤模型的建立及藥物毒副作用的評(píng)價(jià) 接種后第18天，26只裸鼠腫瘤最大徑≥5mm，5只裸鼠未成瘤，成瘤率為83.9%，隨著腫瘤體積增大，部分腫瘤表面出現(xiàn)破潰、結(jié)痂。治療過(guò)程中，裸鼠一般狀況可，未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)，各組裸鼠并未出現(xiàn)明顯的惡性消耗表現(xiàn)，治療結(jié)束后各組裸鼠體重均較治療前增加(P＜0.05，表1)。

表1 治療前后各組裸鼠的體重比較(g，s，n=6)Tab.1 The weight change of different groups after treatment(g, n=6)

表1 治療前后各組裸鼠的體重比較(g，s，n=6)Tab.1 The weight change of different groups after treatment(g, n=6)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with before treatment

Group Before treatment After treatment Control group 18.42±0.98 20.87±1.48(2)Celecoxib group 17.78±0.74 19.18±0.77(2)Tegafur gimeracil oteracil potassium group 17.85±0.97 18.82±1.32(1)Combination group 17.75±0.62 19.03±1.37(1)

2.2 塞來(lái)昔布、替吉奧對(duì)各組瘤重的影響 藥物干預(yù)組腫瘤生長(zhǎng)較對(duì)照組緩慢，取材后，各組移植瘤重量分別為：陰性對(duì)照組2.14±0.79g、塞來(lái)昔布組1.44±0.50g、替吉奧組1.11±0.34g、聯(lián)合給藥組0.44±0.27g。各藥物干預(yù)組瘤重明顯低于陰性對(duì)照組(P＜0.05)，塞來(lái)昔布組與替吉奧組瘤重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，聯(lián)合給藥組瘤重低于塞來(lái)昔布組、替吉奧組(P＜0.05)。塞來(lái)昔布組、替吉奧組、聯(lián)合給藥組抑瘤率分別為32.71%、48.13%、79.44%，由金正均法可知，兩藥合用后產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用，q＞1.15。q=EA+B/(EA+EB－EA×EB)，EA+B為A、B兩藥聯(lián)用后的效應(yīng)，EA、EB分別為兩藥單用的效應(yīng)。

2.3 塞來(lái)昔布、替吉奧對(duì)胃癌裸鼠皮下移植瘤COX-2、VEGF-C表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示，COX-2、VEGF-C表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色染色。塞來(lái)昔布組、聯(lián)合給藥組COX-2、VEGF-C的表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組、替吉奧組(P＜0.05)，替吉奧組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，塞來(lái)昔布組與聯(lián)合給藥組比較亦無(wú)明顯差異(P＞0.05，表2，圖1、2)。

表2 各組腫瘤組織中COX-2、VEGF-C蛋白表達(dá)的光密度值s，n=6)Tab.2 Mean optical density of COX-2, VEGF-C protein expression in tumor tissue of different groups ±s, n=6)

表2 各組腫瘤組織中COX-2、VEGF-C蛋白表達(dá)的光密度值s，n=6)Tab.2 Mean optical density of COX-2, VEGF-C protein expression in tumor tissue of different groups ±s, n=6)

(1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with tegafur gimeracil oteracil potassium group

Group COX-2 VEGF-C Control group 0.0487±0.0076 0.0400±0.0067 Celecoxib group 0.0374±0.0062(1) 0.0317±0.0020(1)Tegafur gimeracil oteracil potassium group 0.0482±0.0070 0.0388±0.0065 Combination group 0.0367±0.0051(1)(2)0.0308±0.0026(1)(2)

圖1 胃癌裸鼠皮下移植瘤組織中COX-2的表達(dá)(免疫組化染色×200)Fig. 1 COX-2 expression in subcutaneous xenograft tumor of gastric cancer in nude mice (Immunohistochemistry staining ×200)

圖2 胃癌裸鼠皮下移植瘤組織中VEGF-C的表達(dá)(免疫組化染色×200)Fig. 2 VEGF-C expression in subcutaneous xenograft tumor of gastric cancer in nude mice (Immunohistochemistry staining ×200)

2.4 各組腫瘤組織中淋巴管密度計(jì)數(shù) 鏡下觀察淋巴管主要分布在腫瘤組織邊緣，管腔大小不一，管壁較薄，由單層淋巴內(nèi)皮細(xì)胞組成。鏡下計(jì)數(shù)陰性對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、替吉奧組、聯(lián)合給藥組淋巴管密度分別為8.60±1.52、4.60±1.14、8.00±1.58、3.80±1.30/HF。塞來(lái)昔布組、聯(lián)合給藥組淋巴管密度明顯低于陰性對(duì)照組、替吉奧組(P＜0.05)，替吉奧組與陰性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，聯(lián)合給藥組與塞來(lái)昔布組比較亦差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖3)。

3 討 論

圖3 胃癌裸鼠皮下移植瘤組織中淋巴管密度比較(免疫組化染色×200)Fig. 3 The lymphatic vessel density in subcutaneous xenograft tumor of gastric cancer in nude mice (Immunohistochemistry staining ×200)

根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需要，胃癌裸鼠皮下腫瘤細(xì)胞接種部位有不同的選擇[7]。一般皮下接種部位多選擇血供豐富、皮下游離空間大的地方，以利于腫瘤生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)選擇背部靠近右前肢并且靠近腋窩部位。本實(shí)驗(yàn)中接種細(xì)胞的數(shù)量參照徐曉萌等[8]的方法確定，保證足夠的細(xì)胞數(shù)量。

塞來(lái)昔布由于選擇性作用于COX-2，減輕了消化道不良反應(yīng)，如胃腸黏膜的損傷、消化性潰瘍等。替吉奧中含有的奧替拉西鉀可減輕5-FU引起的胃腸道不良反應(yīng)。Lai等[9]對(duì)11例伴有惡病質(zhì)的頭頸部惡性腫瘤、胃腸惡性腫瘤患者進(jìn)行的隨機(jī)對(duì)照Ⅱ期臨床研究發(fā)現(xiàn)，與安慰劑組相比，服用塞來(lái)昔布能明顯增加患者體重、體重指數(shù)，提高生活質(zhì)量評(píng)分，且并未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)塞來(lái)昔布組、替吉奧組、聯(lián)合給藥組所用劑量并未引起明顯的不良反應(yīng)。

大量的臨床前期研究表明，COX-2/PGE2信號(hào)通路在惡性腫瘤的發(fā)展中具有重要作用[10]。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，選擇性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布能夠抑制多種腫瘤生長(zhǎng)。Basu等[11]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌自發(fā)性轉(zhuǎn)移性鼠模型中，塞來(lái)昔布明顯抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，可能的機(jī)制為塞來(lái)昔布通過(guò)下調(diào)Akt、Bcl-2的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，下調(diào)VEGF的表達(dá)抑制腫瘤新生血管生成。替吉奧是5-FU的衍生物，其抗腫瘤作用機(jī)制為替加氟經(jīng)肝臟微粒體細(xì)胞色素P450酶系作用轉(zhuǎn)化為5-FU，5-FU在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸，抑制胸苷酸合酶，進(jìn)而抑制DNA的合成，另外5-FU在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶核苷，以偽代謝產(chǎn)物形式摻入RNA中，干擾蛋白質(zhì)合成。商業(yè)化的替吉奧在日本已被批準(zhǔn)用于胃癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、胰腺癌、膽管癌的治療。瘤重變化是評(píng)價(jià)腫瘤治療效果的一個(gè)可靠指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中，塞來(lái)昔布、替吉奧單獨(dú)作用時(shí)不同程度地抑制了腫瘤生長(zhǎng)，而聯(lián)合給藥組表現(xiàn)為協(xié)同作用。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型中，塞來(lái)昔布聯(lián)合5-FU有協(xié)同抗腫瘤作用，可能的機(jī)制為二者均可促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，上調(diào)Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

腫瘤淋巴管生成為從已經(jīng)存在的淋巴管出芽、增殖形成新的淋巴管，或者從循環(huán)中的淋巴內(nèi)皮祖細(xì)胞生成新的淋巴管。已有大量研究證實(shí)腫瘤淋巴管生成可促進(jìn)腫瘤的淋巴管浸潤(rùn)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。VEGF-C是最先發(fā)現(xiàn)的淋巴管生成因子，COX-2是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的淋巴管生成因子。對(duì)手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2的表達(dá)與VEGF-C的表達(dá)、淋巴管密度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13-14]，推測(cè)COX-2通過(guò)上調(diào)VEGF-C的表達(dá)促進(jìn)了淋巴管生成。Su等[15]研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C是COX-2的一個(gè)主要下游基因，COX-2通過(guò)EP1和Her-2受體依賴途徑上調(diào)VEGF-C的表達(dá)。Liu等[16]研究發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布抑制了肺癌Anip973細(xì)胞VEGF-C的表達(dá)，而COX-2的主要代謝產(chǎn)物PGE2可上調(diào)肺癌AGZY83-a細(xì)胞VEGF-C的表達(dá)，并通過(guò)建立動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布抑制VEGF-C的表達(dá)、淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而PGE2則發(fā)揮相反作用，因而推測(cè)COX-2通過(guò)其代謝產(chǎn)物PGE2與其受體EP1/EP4結(jié)合，促進(jìn)了VEGF-C的表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中塞來(lái)昔布可明顯抑制COX-2、VEGF-C的表達(dá)，從而降低淋巴管密度，而替吉奧并無(wú)明顯的抑制作用。可能的機(jī)制為塞來(lái)昔布通過(guò)下調(diào)COX-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制VEGF-C的表達(dá)，降低了淋巴管密度。塞來(lái)昔布聯(lián)合替吉奧的抗腫瘤淋巴管生成作用，明顯優(yōu)于單用替吉奧組。

綜上所述，塞來(lái)昔布、替吉奧單獨(dú)作用均可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，二者聯(lián)合應(yīng)用表現(xiàn)為協(xié)同作用，聯(lián)合給藥組并未出現(xiàn)明顯的毒副作用。塞來(lái)昔布可能通過(guò)下調(diào)COX-2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)VEGF-C的表達(dá)，抑制腫瘤組織淋巴管生成。而替吉奧并無(wú)明顯的抗腫瘤淋巴管生成的作用。塞來(lái)昔布聯(lián)合替吉奧的抗腫瘤作用優(yōu)于單用替吉奧組。

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