范杰，王高頻

緩慢性心律失常(包括竇性心動過緩、病態(tài)竇房結(jié)綜合征和房室傳導(dǎo)阻滯等)是臨床常見的一種心律失常，目前的治療措施主要是植入電子心臟起搏器[1]。盡管電子心臟起搏器治療緩慢性心律失常在技術(shù)上已較為成熟，但仍存在一些無法克服的缺陷[2-3]。因此，重建一個具有正常生理功能的生物心臟起搏器，以取代電子心臟起搏器治療，是當(dāng)今心臟電生理學(xué)界研究的熱點之一[4-6]。本課題組前期研究已證實超級化環(huán)化核苷酸門控陽離子通道4(hHCN4)基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)可在體外分化為心肌樣細(xì)胞[7]，本研究擬將hHCN4基因修飾的大鼠BMSCs細(xì)胞與乳鼠心肌細(xì)胞(CM)進(jìn)行共培養(yǎng)，對其細(xì)胞連接功能及起搏功能進(jìn)行觀察，檢測hHCN4基因修飾的大鼠BMSCs細(xì)胞能否與心肌細(xì)胞建立有效的電機(jī)械連接，旨在為進(jìn)一步進(jìn)行生物起搏治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生1～2d的SPF級SD大鼠20只，成年SD大鼠3只(90～120g)，雌雄不拘，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；小鼠抗大鼠縫隙連接蛋白43(Cx43)單克隆抗體(美國Chemicon公司)；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)、山羊抗小鼠IgG-TRITC熒光二抗、山羊抗兔IgGFITC熒光二抗、DAPI(藍(lán)色熒光)(北京博奧森公司)。倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、透射電鏡(日本Olympus公司)；Western blotting電泳儀、電泳槽(美國EC公司)；轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；Labworks凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 新生大鼠CM的分離培養(yǎng) 分離培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn)[7]，前6d加入0.1mmol/L 5-Brdu抑制非心肌細(xì)胞生長。于共培養(yǎng)前1d將心肌細(xì)胞用50mg/ml DAPI標(biāo)記過夜。

1.3.2 hHCN4基因修飾的BMSCs的構(gòu)建 本課題組前期工作已完成，本實驗選擇轉(zhuǎn)染5d后的BMSCs進(jìn)行共培養(yǎng)。

1.3.3 BMSCs與CM共培養(yǎng) 選擇轉(zhuǎn)染hHCN4基因5d后的BMSCs，用0.125%胰蛋白酶消化數(shù)分鐘至細(xì)胞變橢圓，終止消化，輕輕吹打使貼壁細(xì)胞脫落。CM與BMSCS按4:1比例以3×105/ml密度接種于放有玻片的6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～4d。分組：未與BMSCs共培養(yǎng)的CM(培養(yǎng)時間與其他組相同)設(shè)為空白對照組；未與CM共培養(yǎng)的hHCN4+BMSCs為共培養(yǎng)對照組；hHCN4－BMSCs與CM共培養(yǎng)設(shè)為HCN4－對照組；hHCN4+BMSCs與CM共培養(yǎng)組設(shè)為實驗組。

1.3.4 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的自發(fā)搏動頻率共培養(yǎng)4d后，每組選擇3個標(biāo)本，每個標(biāo)本計數(shù)3個高倍視野，每個視野選擇2個自發(fā)搏動細(xì)胞，計數(shù)1min。分析每組細(xì)胞搏動頻率及其差異。

1.3.5 熒光顯微鏡觀察共培養(yǎng)的兩類細(xì)胞 共培養(yǎng)前用DAPI對CM進(jìn)行標(biāo)記，在波長340nm激發(fā)光下，熒光顯微鏡下觀察CM細(xì)胞呈藍(lán)色，而BMSCs轉(zhuǎn)染有GFP，在波長448nm激發(fā)光下呈綠色。共培養(yǎng)4d后用熒光顯微鏡觀察共培養(yǎng)的細(xì)胞標(biāo)本，以了解兩種細(xì)胞是否可以共存。

1.3.6 Western blotting檢測各組細(xì)胞Cx43的表達(dá)每瓶細(xì)胞洗去培養(yǎng)液后置于冰上，加入1ml細(xì)胞裂解液和10μl PMSF(10mg/ml)，冰上裂解30min，4℃、12 000r/min離心5min后收集上清，BAC法測定蛋白含量，根據(jù)蛋白含量制作樣品。每孔10μl樣品加入適量緩沖液上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，取出PVDF膜，浸入封閉液置于搖床上慢搖1h以上。洗膜液略洗后加入雜交液，Cx-43(1:500)4℃雜交過夜。TBST緩沖液洗3次，每次5min，去除TBST，將含HRP標(biāo)記的二抗加入離心管中，搖床上雜交1h。TBST緩沖液洗3次，每次5min。顯色劑均勻滴在PVDF膜上，反應(yīng)1～2min，上機(jī)檢測。

1.3.7 透射電鏡檢測細(xì)胞縫隙連接情況 以細(xì)胞刮子刮取各組細(xì)胞，離心沉淀，棄去上清液后PBS沖洗；2.5%戊二醛固定，1%四氧化鋨固定，梯度乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，透射電鏡下觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 共培養(yǎng)前的CM和BMSCs 倒置顯微鏡觀察分離的CM 12h后貼壁生長，第2～3天細(xì)胞部分融合，第5天時可見細(xì)胞間相互交織成網(wǎng)，形成細(xì)胞簇，呈同步性自發(fā)搏動，頻率80次/min左右(圖1A)。DAPI標(biāo)記的CM顯示藍(lán)色熒光(圖1B)。BMSCs培養(yǎng)48h后可見散在梭形貼壁細(xì)胞，7d后細(xì)胞逐漸融合。傳代后細(xì)胞逐漸純化，第3代細(xì)胞呈形態(tài)均一、分布均勻的紡錘形。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染hHCN4基因5d后70%左右的BMSCs帶有綠色熒光(圖1C)。

2.2 共培養(yǎng)后心肌細(xì)胞的自發(fā)搏動頻率改變 倒置顯微鏡觀察可見，共培養(yǎng)對照組細(xì)胞無自發(fā)搏動現(xiàn)象，空白對照組細(xì)胞搏動頻率為81±17次/min，與HCN4－對照組(75±19次/min)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。實驗組搏動頻率(128±23次/min)明顯高于其他3個對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 熒光顯微鏡觀察hHCN4+BMSCs與CM的空間位置 CM與hHCN4+BMSCs共培養(yǎng)2d后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞，為hHCN4+BMSCs，同時還有DAPI標(biāo)記的藍(lán)色心肌細(xì)胞核，兩類細(xì)胞在位置上相毗鄰(圖2)。

圖1 共培養(yǎng)前CM和BMSCs的形態(tài)(×200)Fig.1 Morphology of CM and BMSCs before co-culture (×200)

圖2 共培養(yǎng)2d時的CM與BMSCs(×400)Fig.2 BMSCs co-cultured with CM at the second day (Fluorescence microscope ×400)

2.4 Western blotting檢測各組細(xì)胞Cx43的表達(dá)Cx43在各組細(xì)胞的表達(dá)情況見圖3。Western blotting檢測相對光密度值顯示，實驗組Cx43表達(dá)(0.71±0.13)高于共培養(yǎng)對照組(0.16±0.10)和HCN4－對照組(0.36±0.09)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但與空白對照組(0.74±0.08)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 Western blotting檢測各組Cx43的表達(dá)Fig.3 Expression of Cx43 in each group detected by Western blotting

2.5 透射電鏡觀察縫隙連接情況 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，hHCN4+BMSCs共培養(yǎng)組BMSCs可與相鄰CM間形成指狀交錯的連接，并可觀察到相鄰細(xì)胞膜邊緣出現(xiàn)電子密度增高的結(jié)構(gòu)，提示存在縫隙連接(圖4)。

3 討 論

圖4 透射電鏡觀察hHCN4+ BMSCs組細(xì)胞間縫隙連接Fig.4 Intercellular gap junctions in hHCN4+ BMSCs group(Transmission electron microscopy)

本課題組前期研究中，已成功將hHCN4基因通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，并獲得了穩(wěn)定表達(dá)hHCN4通道蛋白的細(xì)胞[7]，但BMSCs不能自發(fā)搏動，因為其上沒有產(chǎn)生動作電位所需的其他離子通道。為此本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，將成功轉(zhuǎn)染hHCN4基因的BMSCs與CM共培養(yǎng)，希望兩類細(xì)胞間能夠形成有效的電機(jī)械連接，使hHCN4基因修飾的BMSCs上產(chǎn)生去極化電流并傳遞給與之連接的CM，誘發(fā)動作電位爆發(fā)，從而產(chǎn)生細(xì)胞的自發(fā)搏動。

近年來，有研究者采用條件培養(yǎng)和共培養(yǎng)的方法模擬體內(nèi)微環(huán)境，結(jié)果證實CM與BMSCs直接接觸在促進(jìn)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化中起著重要作用[8]。有學(xué)者提出這一現(xiàn)象是由于心肌細(xì)胞微環(huán)境中化學(xué)因素以及細(xì)胞間的牽拉力、電生理環(huán)境、直接接觸及細(xì)胞基質(zhì)所提供的信號刺激等原因，共同發(fā)揮了誘導(dǎo)分化作用。趙艷梅等[9]研究了不同誘導(dǎo)條件對大鼠BMSCs體外分化的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)或與CM共培養(yǎng)，均可使BMSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞并表達(dá)Cx43，且共培養(yǎng)的BMSCs分化為心肌細(xì)胞的能力比經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)者強(qiáng)。研究者認(rèn)為BMSCs表面表達(dá)的縫隙連接蛋白(Cx)很可能在BMSCs定向分化為心肌樣細(xì)胞的過程中起關(guān)鍵性作用。

心肌細(xì)胞間的電傳導(dǎo)主要依靠縫隙連接來完成。竇房結(jié)在心臟電傳導(dǎo)活動中起主導(dǎo)作用，其激動頻率的維持和激動的傳導(dǎo)都需要縫隙連接的作用[10]。Cx是構(gòu)成細(xì)胞間縫隙連接的分子基礎(chǔ)，在維持細(xì)胞間電傳導(dǎo)方面起著重要作用[11]。心肌細(xì)胞中存在Cx43、Cx40和Cx45，其中最主要的是Cx43，不管在哪個發(fā)育階段，其在心房和心室細(xì)胞中都有表達(dá)[12-15]。本研究結(jié)果顯示，hHCN4+BMSCs與CM共培養(yǎng)組Cx43表達(dá)程度與空白對照組(CM)相當(dāng)，呈陽性表達(dá)，這是形成縫隙連接的前提。本研究還發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)對照組和hHCN4－BMSCs對照組雖然也表達(dá)Cx43，但其表達(dá)量明顯低于實驗組，提示hHCN4基因的有效表達(dá)可促進(jìn)縫隙連接蛋白的表達(dá)。與其他學(xué)者的研究結(jié)果[16]相比，我們認(rèn)為基因修飾與共培養(yǎng)環(huán)境的雙重作用更有利于BMSCs向心肌細(xì)胞分化的進(jìn)程。

Cx43表達(dá)檢測僅從蛋白水平證實了相鄰的兩類細(xì)胞間存在構(gòu)成縫隙連接的物質(zhì)基礎(chǔ)，但是否能形成功能性的縫隙連接，還需要進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)檢測。本研究透射電鏡結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞可與相鄰細(xì)胞間形成指狀交錯的連接，并可觀察到相鄰細(xì)胞膜邊緣的電子密度增高的結(jié)構(gòu)，提示了縫隙連接的存在。由于實驗條件的限制，雖然沒能利用電耦聯(lián)法或熒光光漂白后恢復(fù)技術(shù)(FRAP)檢測兩類細(xì)胞間Cx43的傳導(dǎo)功能，但國外多個研究已經(jīng)證實解剖上相鄰的兩類細(xì)胞形成有效的縫隙連接就能實現(xiàn)細(xì)胞間的通訊[17-18]。另外本實驗結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞的自發(fā)搏動頻率較對照組明顯加快，這與Cx43的功能是分不開的，因此我們推斷BMSCs與CM之間的Cx43能夠發(fā)揮傳導(dǎo)功能，BMSCs上產(chǎn)生的去極化電流傳導(dǎo)給了與之連接的CM，使自發(fā)搏動頻率顯著增加。

綜上所述，本研究通過hHCN4基因修飾的BMSCs與CM共培養(yǎng)，從分子水平和細(xì)胞水平同時對BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，在雙重作用的影響下，BMSCs與CM形成了功能性縫隙連接，構(gòu)成了具有自發(fā)起搏功能的合胞體，更接近生物起搏模型的要求，為進(jìn)一步進(jìn)行生物起搏治療提供了實驗依據(jù)。

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