馬俊勛，趙曉東，杜楠，楊麗萍，蘇琴，閆柏剛，楊雪嬌，李東惠，黨偉，張憲，姚詠明

近年來(lái)創(chuàng)傷患者逐漸增多，嚴(yán)重創(chuàng)傷應(yīng)激性高血糖因被視為預(yù)后不良的預(yù)警指標(biāo)越來(lái)越受到關(guān)注[1]。臨床上已有證據(jù)顯示胰島素強(qiáng)化治療可有效減少創(chuàng)傷后并發(fā)癥的發(fā)生，降低傷殘及病死率[2]，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)仍處于探索階段，尚無(wú)合適的動(dòng)物模型來(lái)研究胰島素強(qiáng)化治療在嚴(yán)重創(chuàng)傷中的作用及具體機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)就建立高血糖創(chuàng)傷大鼠模型及胰島素強(qiáng)化治療對(duì)其肝臟的保護(hù)作用進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 Wistar大鼠購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均為雄性，8～12周齡，體重120±20g，清潔級(jí)飼養(yǎng)。注射用鏈脲佐菌素(STZ)、D-半乳糖胺(D-gal，美國(guó)Sigma公司)，速眠新Ⅱ(北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立及分組 糖尿病模型制備：大鼠禁食12h，按55mg/kg體重腹腔注射STZ，3d后測(cè)尾靜脈血糖＞13.9mmol/L為糖尿病模型造模成功。肝損傷模型制備：將上述成模高血糖大鼠一次性腹腔注射D-gal(450mg/kg)，肝損傷標(biāo)準(zhǔn)為迅速激發(fā)肝損傷，肝酶活性水平至少升高至正常范圍上限的2倍以上。將成模大鼠隨機(jī)分成A、B兩組，A組為胰島素強(qiáng)化治療組(強(qiáng)化治療組，n=30)，B組為血糖相對(duì)控制組(常規(guī)治療組，n=30)。兩組大鼠均每日4次喂食，飲水不限。A組采用每日4次皮下注射，即早、中、晚喂食前注射普通胰島素，晚21:30注射中效胰島素，控制血糖在6～8mmol/L。B組根據(jù)每日3餐后的即時(shí)血糖注射普通胰島素，控制血糖在9～12mmol/L。血糖檢測(cè)采用美國(guó)強(qiáng)生血糖儀(檢測(cè)尾靜脈血糖)。兩組大鼠在肝損傷后均喂養(yǎng)1周。

1.2.2 一般情況觀察 觀察大鼠食欲、行為、毛發(fā)及死亡情況。

1.2.3 血生化檢測(cè)及病理觀察 分別于肝損傷模型制備前和制備后1、3、5、7d將兩組存活大鼠各處死5只(常規(guī)治療組在造模后7d僅存活4只)，經(jīng)腹主動(dòng)脈抽血，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(T-Bil)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、堿性磷酸酶(ALP)含量。取1、3、5、7d處死大鼠肝臟右葉處組織，以10%中性甲醛液固定12～48h，制作病理切片，取第7天大鼠肝組織行組織電鏡觀察。制作正常大鼠肝臟病理切片作為對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠造模后一般情況及胰島素治療后死亡情況觀察 注射STZ造模3d后，大鼠尾靜脈測(cè)血糖均＞13.9mmol/L。隨后腹腔注射D-gal，大鼠逐漸出現(xiàn)懶動(dòng)，進(jìn)食、進(jìn)水減少，反抗力度減弱，精神疲憊，毛發(fā)站立，步態(tài)不穩(wěn)等現(xiàn)象，部分大鼠出現(xiàn)尿量減少，尿色變黃，大便次數(shù)增多，且不成形，呈稀糊樣。造模成功后兩組大鼠中僅強(qiáng)化治療組死亡2只。給予胰島素治療后，常規(guī)治療組死亡6只(其中第1天4只，第2、7天各1只)。與常規(guī)治療組相比，強(qiáng)化治療組大鼠相同時(shí)間段懶動(dòng)、進(jìn)食水、反抗力度、步態(tài)及二便等情況明顯改善，大鼠死亡數(shù)量明顯減少，共死亡3只(其中第1天1只，第2、5天各1只)。兩組大鼠病死率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 胰島素強(qiáng)化治療后創(chuàng)傷高血糖大鼠肝功能變化模型制備后第1天，常規(guī)治療組與強(qiáng)化治療組大鼠肝功能指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。第3天與常規(guī)治療組比較，強(qiáng)化治療組肝功能開始降低，第5、7天肝功能明顯降低，至第7天基本接近正常，而常規(guī)治療組雖較前有所下降，但仍高于正常，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01，表1)。

2.3 胰島素強(qiáng)化治療后高血糖大鼠肝臟的病理變化 正常大鼠肝臟呈紅褐色，有光澤，質(zhì)軟，表面光滑。常規(guī)治療組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肝臟均代償性增大，有出血。強(qiáng)化治療組各時(shí)間點(diǎn)肝臟稍增大，表面有少許出血點(diǎn)。正常肝臟常規(guī)HE染色見肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞多為單核，肝細(xì)胞索排列整齊，肝板呈條索狀，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝細(xì)胞呈多邊形，核大而圓，位于肝細(xì)胞中央；肝竇內(nèi)及匯管區(qū)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生(圖1A)。肝損傷模型常規(guī)病理切片見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞變性、糖原消失、局灶性炎性浸潤(rùn)，部分肝細(xì)胞破裂，匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)。常規(guī)治療組HE染色與肝損傷模型病理所見基本一致，第1、3天時(shí)肝細(xì)胞變性壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以匯管區(qū)顯著，至第7天時(shí)炎性細(xì)胞有所減少，出現(xiàn)少許增生的新生肝細(xì)胞(圖1C－F)。強(qiáng)化治療組HE染色見肝小葉破壞較輕，肝小葉完整，肝細(xì)胞水腫減輕，第1天病理切片顯示肝細(xì)胞變性壞死稍減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與常規(guī)治療組基本一致，第3、5天肝細(xì)胞變性壞死較前明顯減少，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，開始出現(xiàn)新生肝細(xì)胞，第7天時(shí)肝臟基本恢復(fù)正常，炎性細(xì)胞消失(圖1G－J)。

2.4 透射電鏡觀察 正常大鼠肝細(xì)胞體積大小正常，排列緊密；肝細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，大多單核，核內(nèi)以常染色質(zhì)為主，染色質(zhì)均勻分布，核膜完整；胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，常分布于線粒體附近，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少，線粒體豐富，內(nèi)嵴清楚；次級(jí)溶酶體偶見，以髓樣結(jié)構(gòu)為主；胞質(zhì)中有時(shí)可見脂滴，形狀接近圓形或卵圓形(圖2A)。常規(guī)治療組可見肝細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)疏松，細(xì)胞器分散，胞質(zhì)中脂滴較多；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分核蛋白體從膜上脫落；線粒體腫脹，嵴斷裂或崩解，部分外膜破損；部分胞質(zhì)中出現(xiàn)呈髓樣結(jié)構(gòu)的次級(jí)溶酶體(圖2B)。強(qiáng)化治療組肝細(xì)胞體積正常，細(xì)胞核染色質(zhì)較均勻分布，部分核膜不完整；細(xì)胞質(zhì)中各細(xì)胞器無(wú)明顯變化，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體積數(shù)量均正常，偶可見初級(jí)溶酶體(圖2C)。

表1 肝損傷大鼠胰島素強(qiáng)化治療后肝功能變化s, n=5)Tab.1 Liver function changes after intensive insulin therapy in wound rats ±s, n=5)

表1 肝損傷大鼠胰島素強(qiáng)化治療后肝功能變化s, n=5)Tab.1 Liver function changes after intensive insulin therapy in wound rats ±s, n=5)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with conventional treatment group

Group Before model establishment After model establishment 1d 3d 5d 7d Conventional treatment group ALT(U/L) 38.4±13.5 247.2±23.3 206.3±21.6 144.3±23.1 78.7±18.7 AST(U/L) 157.0±12.9 268.6±27.9 245.6±23.9 213.8±24.4 185.3±18.6 T-Bil(μmol/L) 4.98±2.24 21.35±4.30 19.02±5.65 14.56±9.40 10.43±7.30 ALB(g/L) 32.1±0.9 24.1±1.9 23.2±1.6 25.8±0.8 27.6±0.9 TP(g/L) 50.0±2.7 33.8±3.5 36.5±5.5 39.8±9.8 45.8±6.3 ALP(U/L) 208.1±29.1 346.2±28.4 316.3±30.2 285.6±23.4 243.6±24.3 Intensive insulin group ALT(U/L) 40.1±12.1 256.4±21.3 187.2±14.8(2) 103.5±19.8(2) 42.3±14.7(2)AST(U/L) 151.0±12.0 265.7±18.4 221.5±20.6(2) 187.5±15.3(2) 164.3±13.6(2)T-Bil(μmol/L) 5.23±1.98 20.16±10.30 15.40±7.42(1) 10.45±4.33(1) 6.52±2.05(2)ALB(g/L) 31.6±0.8 23.6±1.1 26.6±1.2(2) 28.5±1.8(2) 30.2±0.8(2)TP(g/L) 51.3±2.9 35.6±3.1 38.2±2.5(2) 44.8±3.2(1) 48.7±2.4(1)ALP(U/L) 205.6±26.3 335.5±30.2 294.2±30.2(2) 253.6±20.3(2) 223.3±25.2(2)

圖1 大鼠肝組織病理變化觀察(HE)Fig.1 Changes of hepatic pathology (HE)

3 討 論

圖2 肝細(xì)胞透射電鏡觀察(×5000)Fig.2 Observation of hepatic cells by transmission electron microscope(×5000)

嚴(yán)重創(chuàng)傷患者多因感染[3]、多臟器衰竭[4]等死亡，其中凝血系統(tǒng)紊亂、內(nèi)皮細(xì)胞損傷均與肝臟損傷相關(guān)，嚴(yán)重者將發(fā)生肝衰竭，導(dǎo)致一系列臨床后果。因此，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，需要選擇一個(gè)好的肝臟損傷動(dòng)物模型，以幫助解決臨床無(wú)法實(shí)現(xiàn)的藥物篩選、基礎(chǔ)研究、新技術(shù)應(yīng)用等難題。STZ是一種廣譜抗菌素，具有抗菌、抗腫瘤活性，以及致糖尿病的副作用，對(duì)動(dòng)物的胰島細(xì)胞具有高度選擇毒性作用[5-9]，是目前廣泛采用的糖尿病動(dòng)物模型化學(xué)誘導(dǎo)劑[10]。有研究指出，大鼠尾靜脈注射STZ的成模率可達(dá)90%[11]。因腹腔注射較尾靜脈注射簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確、快速，現(xiàn)多采用腹腔注射法。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)STZ腹腔注射后，大鼠血糖均大于13.9mmol/L，成功造模，且病死率極低。

目前常用的肝損傷模型包括化學(xué)性、免疫性、酒精性肝損傷動(dòng)物模型以及外科手術(shù)動(dòng)物模型[12-21]等。參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)采取D-gal腹腔注射制備大鼠肝損傷模型。雖然D-gal作為肝毒劑已被公認(rèn)，但其造成肝損傷的劑量國(guó)內(nèi)外報(bào)道差別較大(100～2300mg/kg)。劉霞等[22]對(duì)此模型進(jìn)行了改進(jìn)，給予一次性腹腔注射450mg/kg D-gal，制成的急性肝損傷模型具有肝損傷指標(biāo)明確，病變恒定，重復(fù)性好，器官選擇性強(qiáng)，周期短，給藥適量，動(dòng)物存活率高等特點(diǎn)。

本課題組查閱文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的嚴(yán)重創(chuàng)傷應(yīng)激性高血糖動(dòng)物模型，預(yù)實(shí)驗(yàn)制備的創(chuàng)傷性休克大鼠模型血糖不理想，僅有20%的大鼠血糖較正常高，且未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，大鼠病死率也較高，故本研究先制備大鼠高血糖模型，再行肝損傷模型制備，取得了較滿意的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)大鼠全部造模成功，造模成功后兩組大鼠中僅強(qiáng)化治療組死亡2只。造模成功后給予胰島素治療，其中常規(guī)治療組共死亡6只，強(qiáng)化治療組死亡3只，兩組病死率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

本研究中大鼠肝損傷后出現(xiàn)了較為顯著的肝功能障礙，表現(xiàn)為ALT、AST、T-Bil升高，ALB、TP降低，ALP升高。與常規(guī)治療比較，胰島素強(qiáng)化治療可增加ALB、TP含量、降低ALP水平，明顯保護(hù)損傷肝臟，且隨著時(shí)間推移，保護(hù)功能加強(qiáng)，至第7天時(shí)，強(qiáng)化治療組大鼠肝功能已基本恢復(fù)正常。而常規(guī)治療組肝功能雖較治療前有所降低，但仍明顯高于強(qiáng)化治療組，表明血糖相對(duì)控制后肝臟仍有明顯損傷，而胰島素強(qiáng)化治療有效降低血糖后，能使受損肝臟得以修復(fù)，避免肝衰竭的發(fā)生。

肝臟病理大體標(biāo)本顯示，強(qiáng)化治療組大鼠肝臟基本與正常肝臟一致，有光澤，質(zhì)軟，表面光滑，僅有少許出血點(diǎn)。常規(guī)治療組肝臟則明顯增大，色澤暗黑，質(zhì)地稍硬，有多處出血。HE染色顯示常規(guī)治療組肝細(xì)胞變性壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以門管區(qū)顯著，肝小葉破壞。強(qiáng)化治療組肝小葉完整，肝細(xì)胞水腫輕，可見新生肝細(xì)胞，至第7天時(shí)肝臟基本恢復(fù)正常，炎性細(xì)胞消失。肝組織透射電鏡觀察結(jié)果與上述一致。

綜上所述，肝損傷后肝功能異常，伴隨病理改變和肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，給予胰島素強(qiáng)化治療后，肝功能、病理及電鏡觀察均明顯改善，提示胰島素強(qiáng)化治療控制應(yīng)激性高血糖后，能降低包括肝衰竭在內(nèi)的多器官功能衰竭。

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