孟 芳 張卿 蔡婧怡 禹思宇 趙和平 朱忠武 唐連飛

(湖南出入境檢驗檢疫局 湖南長沙 410004)

1 前言

熒光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)是分子生物學中廣泛運用的一種新定量試驗技術，是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實施在線監(jiān)控反應過程，結合相應的軟件可以對參照物進行分析，計算檢測樣品模板的初始濃度。目前這項技術越來越多地運用到食品檢測之中，例如，用熒光定量PCR技術來檢測食品中的轉基因成分［1］和微生物成分等［2］，其中部分熒光定量PCR檢測方法已經作為標準推廣于社會。但是熒光定量PCR技術在食品檢測的運用過程中也受到一些限制，主要是因為各種食品經過不同程度的深度加工，其中所含有的DNA成分遭到不同程度的破壞，并且在生產過程中，混入不同的添加劑和佐料，使食品的成分更加復雜［3，4］。如何提取出高質量的DNA成為熒光定量PCR應用于食品檢測的一個限制因素。

據營養(yǎng)學專家介紹，羊奶在國際營養(yǎng)學界被稱為“奶中之王”，羊奶的脂肪顆粒體積為牛奶的三分之一，更利于人體吸收，并且長期飲用不會引起發(fā)胖。羊奶中的維生素及微量元素明顯高于牛奶，美國、歐洲的部分國家均把羊奶視為營養(yǎng)佳品，歐洲鮮羊奶的售價是牛奶的7倍。但是現在市面上羊奶原料緊張，部分商販以牛奶摻入羊奶中以降低制造成本。本方法無需進行DNA提取，奶粉經核酸釋放劑處理后可直接進行熒光定量PCR檢測，并采用熒光定量PCR方法來鑒別牛、羊奶粉。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品與試劑

不同品牌牛、羊奶粉:均從超市購買;苯酚、氯仿、異戊醇等試劑:均為分析純;核酸定量檢測試劑盒(PCR－熒光探針法):由圣湘生物提供。

2.1.2 儀器

熒光定量PCR擴增儀LC480:羅氏公司;臺式高速離心機Mikro200:HETTICH公司;微量分光光度計Nannodrop1000:Thermo公司。

2.2 方法

2.2.1 定量PCR反應體系

取10mg奶粉樣品于2ml的Eppordorf管中，加100μL蒸餾水溶解奶粉，取10μL溶解后的液態(tài)奶，再加入10μL核酸釋放劑，吹打混勻5次，等待10min。

按下列組分配制PCR反應液:PCR反應液16μL;熱啟動酶1μL;兩套引物和探針同時加入，上下游引物各1μL;探針溶液1μL;經核酸釋放劑處理過的樣本5μL。

2.2.2 定量PCR反應條件

依據同源性分析結果，最終選擇牛羊線粒體DNA的12SrRNA種內保守種間特異的區(qū)域作為牛羊特異檢測的靶序列。依據靶序列，用Primers軟件設計檢測牛源成分的實時定量引物和探針及檢測羊源成分實時定量引物和探針。牛源性探針5’端標記FAM熒光基團，3’端標記TAMRA淬滅基團，羊源性探針5’端標記HEX熒光基團，3’端標記TAMRA淬滅基團。引物和探針由大連寶生物公司合成。引物探針序列及各種參數［10］見表1。反應條件:95℃ 10sec;95℃ 5sec，60℃30sec 40個循環(huán)。

表1 引物及探針序列

3 結果與分析

3.1 定量PCR鑒別牛羊奶粉方法的建立

在同一反應管內對牛、羊的12SrRNA同時進行擴增，應用多色熒光檢測技術，對反應液中含有的兩種不同熒光進行兩通道同步檢測，實現多色熒光同步檢測。結果見下表2、圖1、圖2。結果表明羊奶粉中無牛奶成分，牛奶粉中也無羊奶成分。檢測過程中僅需奶粉5mg，表明該方法所需樣本少、無需進行DNA提取，操作過程簡單省時。

表2 牛、羊奶粉熒光值及結果判定

圖1 羊奶粉中牛源性成分鑒定結果

圖2 牛奶粉中羊源性成分鑒定成果

3.2 定量PCR鑒別牛羊奶粉方法的應用

對從超市購買的6種不同品牌的羊奶粉進行鑒別檢測。結果顯示(圖3)FAM通道除陽性對照外，6個羊奶粉樣品均未出現擴增曲線，表明這6個羊奶粉中沒有摻入牛奶成分。另外6個羊奶粉HEX通道均出現典型擴增曲線(圖4)，表明其確為羊奶粉。

表3 6種品牌羊奶粉熒光PCR擴增結果

圖3 6種品牌羊奶粉中牛源性成分的鑒定結果

圖4 6種品牌羊奶粉中羊源性成分的鑒定

3.3 羊奶粉中熒光PCR檢測牛奶粉的敏感性分析

分別稱取1g羊奶粉和牛奶粉，加入10mL去離子水溶解。同時，將牛奶以不同的比例摻入純牛奶中，提取DNA并進行熒光PCR擴增，結果如圖5所示，當牛奶以 0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20% 的比例(體積)摻入至羊奶中時，均能通過熒光PCR得到擴增(如圖5)，且牛奶含量越高CT值越小，表明本法敏感性高。

圖5 檢測含不同比例牛奶的羊奶的熒光PCR結果

4 討論

奶食品有牛奶、馬奶、山羊奶等。在歐美國家羊奶被視為乳品中精品，稱作“貴族奶”，國際學界譽為“奶中之王”。羊奶因其營養(yǎng)價值更優(yōu)于牛奶，市場售價高于奶牛，加上現在市面上羊奶原料緊張，部分商販以牛奶摻入羊奶中以降低制造成本，這嚴重損害了消費者的利益。

目前沒有對羊奶粉成分摻假檢測方法的報道，僅有個別對于牛奶成分摻假檢測方法的報道:吳茹怡［5］采用化學方法檢測牛奶中的豆質成分和大米淀粉成分等，但是該方法過于表觀，且靈敏度不夠;皮付偉等［6］采用近紅外的分析方法來檢測牛奶的成分，但是對牛奶中的羊源性成分檢測不能判斷。本實驗采用熒光定量PCR方法鑒別奶粉中的牛、羊源性成分，可鑒別羊奶粉的真假。實驗證明，該方法操作簡單可行，能檢測到羊奶中摻入的牛奶成分低至0.1%，靈敏度高。

之前的研究中運用以DNA為基礎的熒光定量PCR方法檢測奶粉中牛羊源性成分的關鍵在于DNA提取的成功與否。由于不同的奶粉具有各不相同的功能，因此其成分及加工工藝也都各不相同，各個品種之間的差異性很大，在提取DNA時要充分考慮到各類成分對DNA提取數量和質量的影響，同時也要考慮到加工工藝對 DNA的降解影響［7］。田雨［8］曾從牛乳中的白細胞中提取牛奶的DNA，但是，該方法需要的樣品多，提取得到的DNA不僅濃度低，且蛋白含量過高。覃芳芳［9］將酚仿抽提DNA的方法和前處理相結合得到了一種快速簡便的從牛奶中提取DNA的方法，但該方法更適用于牛奶中植物成分DNA的提取。以上方法都需要經過DNA提取的過程，費時費力且DNA質量和純度并不高，本實驗不需要經過DNA的提取過程，微量樣本經核酸釋放劑裂解后直接可以進行熒光定量PCR檢測。該方法快速簡便，且靈敏度高。另外，該方法全過程僅需1.5h左右，與其他方法相比更快速更適用于推廣。本實驗建立起來的牛羊奶粉的鑒定方法快速、靈敏，可利用該方法來鑒別奶粉，打假治劣、維護消費者權益。

［1］蔡慧農，劉光明，蘇文金，等.TaqMan探針用于轉基因食品的熒光定量 PCR檢測［J］.食品與發(fā)酵工程，2008，29(12):1－6.

［2］馬兆飛，李潔莉，胡紅琴，等.PCR和實時PCR技術快速檢測牛奶樣品中的沙門氏茵［J］.中國食品學報，2008，8(5):132－137.

［3］邵碧英，張體銀，楊婕，等.動物產品及飼料中牛源和羊源性成分PCR檢測方法的優(yōu)化［J］.中國獸醫(yī)科技，2005，35(3):225－229.

［4］陳沁，徐仙，姚麗萍.牛奶摻豆?jié){和奶粉的PCR檢測［J］.生物技術通報，2010，5.162 －165.

［5］吳茹怡.牛奶摻假物檢驗方法研究［J］.大眾科技，2005(9):91－92.

［6］皮付偉，王燕嶺，魯超，等.CCD短波近紅外光譜儀測定牛奶成分的可行性研究［J］.現代科學儀器，2006(4):34，36.

［7］邵碧英，楊婕，張體銀.動物產品的DNA提取方法［J］.畜牧與獸醫(yī)，2005，37(9):47 －49.

［8］田雨.從牛奶中分離DNA方法的建立［J］.乳業(yè)科學與技術，2006，3:112 －113.

［9］覃芳芳，鄧鴻鈴，郭新東，等.牛奶中植物成分的PCR檢測方法研究［J］.食品科學，2008，29(6):234－236.

［10］鄭文文.飼料中牛羊源成分熒光定量PCR檢測方法的建立［D］.吉林:吉林大學碩士學位論文，2009，6:13.