付健，羅文軍，孫建明，唐博，陳以寬

血小板衍生生長因子C(platelet-derived growth factor-C，PDGF-C)是PDGF/VEGF家族新近發(fā)現(xiàn)的生長因子，其活化形式為PDGF-CC，具有強烈的促血管新生能力，是病理性新生血管形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，且其作用靶點比較廣泛，其促進血管新生作用可能不依賴于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[1]。新生血管形成是血栓機化再通的關(guān)鍵步驟[2]。靜脈血栓中新生血管形成比動脈血栓更為廣泛[3]。目前PDGF-CC是否參與了靜脈血栓的溶解尚不清楚，本實驗主要探討了大鼠靜脈血栓溶解過程中PDGFCC的表達情況及其意義，旨在為靜脈血栓的臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 87只清潔級SD雄性大鼠(由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，8周齡，SPF清潔實驗室喂養(yǎng)1個月后體重為300±10g。

1.1.2 主要儀器及試劑 冷凍離心機(Beck Man Coulter，美國)，超聲勻漿器(Sonics，美國)，核酸蛋白定量儀、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad，美國)，蛋白提取試劑盒(凱基公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(Pierce，美國)，PDGF-CC多克隆抗體(SC-18228)、GAPDH單克隆抗體、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記小鼠抗山羊IgG(Santa Cruz，美國)，增強化學發(fā)光檢驗試劑盒ECL(Millipore，美國)，RNA提取試劑盒(TaKaRa，日本)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將SD大鼠隨機分為對照組和血栓組。對照組(n=12)為正常成年雄性大鼠，取大鼠下腔靜脈血管壁作為標本；血栓組共分為6個亞組(n=12)，分別于下腔靜脈血栓模型建立后第1、3、7、14、21、28天取下腔靜脈血管壁及血栓作為標本。

1.2.2 大鼠下腔靜脈血栓模型的建立 參照Brill等[4]的方法并加以改進。SD大鼠在新環(huán)境下適應性喂養(yǎng)1個月，待體重達300±10g后，采用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔內(nèi)麻醉，取仰臥位，四肢外展固定，腹部備皮、消毒、鋪巾，正中切口進腹。顯露左腎靜脈以下下腔靜脈并結(jié)扎各屬支，順下腔靜脈放置26G一次性注射器針頭，以4-0絲線于左腎靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈和針頭，取出26G針頭，使下腔靜脈縮窄80%以上，用神經(jīng)血管鉗阻斷下腔靜脈1min，松開30s，不同部位各重復2次后縫合腹壁。術(shù)后動物自由飲水，正常飼養(yǎng)，不用抗生素。

1.2.3 組織標本獲取 大鼠采用水合氯醛腹腔內(nèi)麻醉，經(jīng)原腹部切口打開腹腔，解剖左腎靜脈以下下腔靜脈至左右髂總靜脈匯合處，切取左腎靜脈以下下腔靜脈及其內(nèi)部血栓。分別取對照組下腔靜脈壁及血栓組術(shù)后1、3、7、14、21、28d(每時間點各12只大鼠)左腎靜脈以下下腔靜脈及其內(nèi)部血栓標本，每組取6只大鼠標本，錫箔紙包裹，液氮中保存，以備Western blotting檢測PDGF-CC蛋白表達，其余6只大鼠標本置于PCR保存液內(nèi)，–4°冰箱保存，備用于實時熒光定量PCR(Real-time qPCR)檢測PDGF-CC mRNA的表達。另取血栓組術(shù)后7d(n=3)左腎靜脈以下下腔靜脈及其內(nèi)部血栓標本，4%多聚甲醛溶液中過夜固定，用于病理組織形態(tài)學和免疫組化觀察。

1.2.4 Western blotting檢測PDGF-CC蛋白表達 收集左腎靜脈以下下腔靜脈及內(nèi)部血栓標本后，采用凱基公司蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，具體操作按說明書進行。蛋白提取液樣品行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，取膜用雙蒸水洗5min，甲醇浸泡3s，雙蒸水及TBS各洗5min，加入含5%脫脂奶粉的TBS-Tween中于室溫孵育1h；于室溫下用TBSTween漂洗5min×3次，然后加入3ml PDGF-CC多克隆抗體(一抗，1:700)4℃孵育過夜；次晨于室溫下用TBS-Tween漂洗5min×3次；膜放入含有辣根酶標記小鼠抗山羊IgG(二抗，1:10 000)的TBS-Tween液中，37℃孵育30min，室溫搖床振蕩30min；TBSTween洗膜5min×3次，TBS洗膜5min；采用增強化學發(fā)光檢測試劑盒ECL顯影于X線膠片上，然后用UVP凝膠成像系統(tǒng)分析目標蛋白條帶的平均光密度值。

1.2.5 RT-qPCR檢測PDGF-CC mRNA的表達 收集血栓組及對照組左腎靜脈以下下腔靜脈及其內(nèi)部血栓標本，用1ml Trizol抽提總RNA，根據(jù)M-MLV操作說明進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA后以rACTB為內(nèi)參照行qPCR，SYBR Green法熒光定量分析各基因的蛋白表達，結(jié)果以2–ΔΔCt表示。所用引物序列如下：PDGF-C正向5'-CCAGCTGACTTTGATGAGAGA-3'，反向5'-CATCACTGGGCTCCTCAACT-3'，產(chǎn)物大小729bp；ACTB正向5'-TTCTTGGGTATGGAATCCTG TG-3'，反向5'-GGAGGAGCAATGATCヰ GATCヰ -3'，產(chǎn)物大小203bp。引物由三博遠志生物技術(shù)公司合成。

1.2.6 病理組織形態(tài)學及免疫組化觀察 取3只血栓組術(shù)后7d左腎靜脈以下下腔靜脈及其內(nèi)部血栓標本，4%多聚甲醛溶液中固定過夜，石蠟包埋、切片，分別行HE染色、Masson三色特殊染色法及PDGF-CC免疫組化。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，加入適量抗原修復液后用微波爐進行抗原修復，滴加3%過氧化氫室溫孵育10min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗5min×3次；滴加5%羊血清封閉液，室溫孵育15min；滴加1:100羊抗鼠PDGF-CC多克隆抗體，以加入PBS作為陰性對照，4℃過夜，PBS洗5min×3次；滴加1:100 HRP標記兔抗羊二抗，室溫1h，吸除二抗，PBS洗5min×3次；DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。Western blotting及實時熒光定量PCR檢測結(jié)果比較均采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Mann-Whitney檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 PDGF-CC蛋白表達檢測結(jié)果 Western blotting檢測顯示，大鼠下腔靜脈血栓溶解過程中靜脈血栓內(nèi)均有PDGF-CC蛋白表達(圖1)，術(shù)后1、3、7、14、21d的相對光密度值分別為0.415、0.384、0.126、0.643、0.399，均顯著高于對照組(0.095)及術(shù)后28d(0.119)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而術(shù)后28d與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。大鼠下腔靜脈血栓溶解過程中下腔靜脈血管壁中均有PDGF-CC蛋白表達水平(圖2)，術(shù)后1、3、7、14、21、28d的相對光密度值分別0.115、0.135、0.126、0.143、0.099、0.075，與對照組(0.095)比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 PDGF-CC mRNA表達檢測結(jié)果 實時熒光定量PCR檢測顯示，術(shù)后1、3、7、14、21、28d下腔靜脈血栓中PDGF-CC mRNA的相對表達量(與對照組比較)分別為12.13、23.75、77.71、20.82、14.22、2.93，均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中術(shù)后第7天增高最明顯，達對照組的77.71倍，此后表達量逐漸下降。術(shù)后1、3、7、14、21、28d下腔靜脈血管壁中PDGF-CC mRNA的相對表達量分別為0.95、2.12、2.36、1.36、1.55、1.12，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 大鼠下腔靜脈血栓溶解過程中血栓內(nèi)PDGF-CC的表達(Western blotting)Fig. 1 Expressions of PDGF-CC protein in resolving thrombus of rat's inferior vena cava (Western blotting)

圖2 大鼠下腔靜脈血栓溶解過程中下腔靜脈壁的PDGFCC表達(Western blotting)Fig. 2 Expressions of PDGF-CC protein in rat's inferior vena caval wall during the venous thrombus resolution (Western bloは ing)

2.3 病理組織形態(tài)學及免疫組化觀察結(jié)果 術(shù)后7d大鼠下腔靜脈血栓逐漸機化再通，HE染色可見新生血管形成及部分血栓機化再通，Masson染色切片中膠原纖維、黏液、細胞外基質(zhì)呈藍色，胞質(zhì)呈紅色，胞核呈黑藍色，根據(jù)膠原纖維及細胞外基質(zhì)的染色情況可更直觀地觀察血栓成分及血栓機化再通情況(圖3)。免疫組化染色結(jié)果顯示：PDGF-CC陽性細胞胞質(zhì)呈棕黃色，陽性細胞類型以血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、單核細胞、血管平滑肌細胞多見，多位于血栓體的邊緣、血栓體與血管壁間隙區(qū)域(圖4)。

圖3 術(shù)后7d大鼠下腔靜脈血栓病理組織學觀察結(jié)果(×100)Fig. 3 Histopathology of rat's inferior vena caval thrombus 7 days after operation (×100)

圖4 術(shù)后7d大鼠下腔靜脈血栓PDGF-CC免疫組化染色結(jié)果Fig. 4 Immunohistochemistry staining of rat's inferior vena caval thrombus (7 days after operation), showing the positively expressed PDGF-CC

3 討 論

靜脈血栓栓塞癥(venous thrombus embolism，VTE)是血管外科的常見疾病，其發(fā)生率有逐漸增高的趨勢，但目前藥物和手術(shù)治療均存在諸多限制，而血栓的自然溶解過程又異常緩慢，導致靜脈血栓后綜合征發(fā)生率居高不下，嚴重影響患者生活質(zhì)量，也給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔[5-6]，因此臨床迫切需要更高效而快速的促進血栓溶解、機化和再通的治療手段。新近研究表明，機體在缺血、缺氧或閉塞等病理狀態(tài)下可通過新生血管形成來增加側(cè)支循環(huán)、改善組織缺血狀態(tài)、促進血管再通[7-8]，這一過程被稱為血管閉塞性疾病的“分子搭橋術(shù)”或“生物搭橋術(shù)”。近些年的研究發(fā)現(xiàn)促進血管新生有助于加快血栓的溶解吸收，而血管生長因子在這一過程中發(fā)揮了重要作用，引起廣泛關(guān)注[9]。

PDGF是貯存于血小板α顆粒中的一種堿性蛋白質(zhì)，為低分子量促細胞分裂素，能刺激停滯于G0/G1期的成纖維細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、平滑肌細胞等多種細胞進入分裂增殖周期，其過度表達與多種疾病如腫瘤、糖尿病、纖維化疾病和動脈粥樣硬化等有密切關(guān)系[10-11]。PDGF家族包括4個成員，即PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D。Li等[12]研究顯示，PDGF家族的PDGF-CC因子可刺激血管新生和成熟，促進缺血組織的血運重建，促進內(nèi)皮細胞的遷移及血管萌發(fā)。Cao等[13]在小鼠角膜血管新生實驗中證實，PDGF-CC有較強的促進血管新生能力。另有研究顯示灌注PDGF-CC可促進缺血心臟的血供重建及誘導缺血肢體的血管新生，這些多重生物學效應是VEGF和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等其他生長因子所不具備的獨特功能[14]。最新研究表明，PDGFCC是病理性新生血管形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，具有多效性、多靶點、不依賴VEGF等特點[1]。血栓機化再通的關(guān)鍵步驟是新生血管形成[3]，在靜脈血栓中，新生血管形成比動脈血栓中更為廣泛[2]。VEGF是最早被發(fā)現(xiàn)的在靜脈血栓溶解過程中有表達的血管生長因子，且后續(xù)實驗證實其具有促進血栓溶解的作用，VEGF基因轉(zhuǎn)移治療可促進血栓的機化再通[15-17]。

本研究結(jié)果顯示大鼠靜脈血栓自然溶解過程中存在著PDGF-CC的表達，且其蛋白和mRNA表達量與血栓再通時間有一定關(guān)系，這是繼VEGF之后發(fā)現(xiàn)的又一種在靜脈血栓溶解過程中表達的細胞因子。因此本實驗為后續(xù)血管生長因子促進血栓溶解的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。首先，動物模型不能完全模擬人類靜脈血栓形成的病理生理過程，在建立大鼠下腔靜脈血栓模型時，本實驗未采用下腔靜脈結(jié)扎、彩超定位下腔靜脈縮窄、腔內(nèi)注射凝血酶或其他止血藥物等傳統(tǒng)方法[18-20]，而是應用Brill等[4]描述的下腔靜脈縮窄聯(lián)合靜脈壁機械損傷的方法并加以改進，因為這種處理更符合近年提出的血栓形成的三大因素[21]，更能準確地模擬體內(nèi)血栓形成的自然過程。其次，大鼠下腔靜脈血栓溶解過程中PDGF-CC的Western blotting檢測結(jié)果顯示，術(shù)后第1天開始即有PDGF-CC蛋白表達，其含量逐漸增加，直至術(shù)后第7天達高峰，此后開始逐漸下降，在術(shù)后第28天時已基本降至正常水平。動物實驗證實，靜脈血栓的機化再通可能開始于靜脈血栓形成后24h，隨著靜脈血栓的水分被吸收，血栓開始收縮，導致血栓與靜脈壁內(nèi)膜之間產(chǎn)生一些裂隙，周圍新生的血管內(nèi)皮細胞長入并覆蓋于裂隙表面形成新生血管，這些新生血管相互吻合溝通，使阻塞的靜脈部分恢復血流，術(shù)后3～4周基本可實現(xiàn)血栓再通[22]，這與本實驗中PDGF-CC蛋白的表達變化一致。因此，靜脈血栓中PDGF-CC蛋白的表達與大鼠下腔靜脈血栓機化再通過程有一定的量-時間關(guān)系，提示PDGF-CC參與了靜脈血栓的機化再通過程，并發(fā)揮重要作用。同時，這種量-時間關(guān)系與PDGF-CC mRNA的表達結(jié)果也是一致的。最后，在病理組織學及免疫組化觀察中，PDGF-CC的表達主要集中于靜脈血栓與靜脈壁之間以及血栓中的內(nèi)皮樣細胞組成的管腔結(jié)構(gòu)中，這一現(xiàn)象提示，在靜脈血栓機化再通過程中，PDGF-CC可能發(fā)揮了促進血管新生的作用。

綜上所述，本實驗證實PDGF-CC在靜脈血栓溶解過程中存在表達，并在血栓機化、再通過程中起著一定的作用，其機制可能是PDGF-CC能促進血管的新生，也可能是通過其他作用機制促進血栓的機化、再通，具體尚需進一步研究證實。

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