林文弢，王 震，翁錫全，徐國(guó)琴，黃麗英

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞有機(jī)體為保持自身組織穩(wěn)定、調(diào)控細(xì)胞增殖與死亡之間的平衡，由基因調(diào)控的主動(dòng)、程序性死亡過程[1]，是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的必要機(jī)制。研究表明，按細(xì)胞凋亡功能來分類，調(diào)控的基因常分為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因和抑制細(xì)胞凋亡2大類。在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2家族成員起著相當(dāng)重要的作用[2]。運(yùn)動(dòng)對(duì)細(xì)胞凋亡影響的研究也證明，力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響較為明顯[3]，而有關(guān)抗阻訓(xùn)練對(duì)骨骼肌細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA和線粒體膜電位（ΔΨmt）下降的細(xì)胞百分率的影響，以及Bcl-2/Bax mRNA比值的變化與線粒體膜電位（ΔΨmt）下降的細(xì)胞百分率有何關(guān)系等的研究較少。本文以自然衰老的雄性大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，重點(diǎn)探討衰老雄性大鼠8周抗阻訓(xùn)練后的腓腸肌Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平和線粒體膜電位（ΔΨmt）下降的細(xì)胞百分率的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

實(shí)驗(yàn)對(duì)象為18月齡衰老的大鼠，該衰老大鼠為自然衰老。從廣東生物醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買11月齡雄性SD大鼠（SCXK（粵）2008-0002），大鼠體重為（779±50）g。按常規(guī)方法分籠飼養(yǎng)至18月齡，飼養(yǎng)過程控制溫度和濕度，室溫（23±2）℃，濕度40%～60%，飲食控制在每籠每日90 g，每籠3只大鼠，自然晝夜節(jié)律變化光照，并且保持通風(fēng)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

選18月齡衰老大鼠45只隨機(jī)分為衰老安靜組，0%、30%、50%、70%最大負(fù)重訓(xùn)練組，每組8只。抗阻訓(xùn)練方式為尾部負(fù)重跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，坡度為35°，讓衰老大鼠往跑臺(tái)上爬，跑速為15m/min。大鼠抗阻訓(xùn)練日訓(xùn)練方案見表1，適應(yīng)性運(yùn)動(dòng)1周后開始正式訓(xùn)練，隔天進(jìn)行1次，為期8周。

表1 大鼠抗阻訓(xùn)練每日訓(xùn)練方案Table1 The training program of rat resistance training per day

1.2 樣品采集

負(fù)重抗阻訓(xùn)練8周、所有大鼠禁食12 h左右后，稱體重，用10%水合氯醛300 mg/kg.wt腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，即刻取出腓腸肌用冷生理鹽水漂洗去血液，濾紙吸干，用錫箔紙包裹，立即置于液氮中速凍，轉(zhuǎn)放于-70℃冰箱保存。

1.3 測(cè)試指標(biāo)與檢測(cè)步驟

Bcl-2、Bax mRNA采用RT-PCR方法檢測(cè)，儀器為PCR儀，試劑購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司。Bcl-2、Bax mRNA檢測(cè)步驟：（1）RNA抽提；（2）RNA鑒定；（3） 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；（4）qPCR檢測(cè)；（5）相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

線粒體膜電位采用JC-1脂質(zhì)熒光染料法檢測(cè)（線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒批號(hào)：KGA603，規(guī)格：50T），儀器為流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司，BDFACSCalibur），試劑購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。線粒體膜電位檢測(cè)步驟：（1）組織勻漿經(jīng)差速離心法分離出線粒體；（2）提取上述線粒體用PBS清洗2次；（3）取100uL 10×Incubation Buffer，加900uL滅菌去離子水稀釋成1×Incubation Buffer，混勻并預(yù)熱至 37℃；（4）吸取 500uL 1×Incubation Buffer，加入1uLJC-1，渦旋混勻配成JC-1工作液；（5）取500uLJC-1工作液將線粒體均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育20min；（6）室溫離心（2000rpm，5min）搜集線粒體，用1×Incubation Buffer洗2次；（7）吸取 500uL 1×Incubation Buffer重新懸浮線粒體；（8）上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。所有測(cè)試指標(biāo)均由專人測(cè)試。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。顯著性差異采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05，極顯著性水平為P<0.01。

2 研究結(jié)果

2.1 8周抗阻訓(xùn)練對(duì)衰老大鼠腓腸肌凋亡調(diào)控基因Bcl-2/BaxmRNA比值的影響

衰老安靜組與各抗阻訓(xùn)練組大鼠腓腸肌Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)及比值的比較見表2。8周抗阻訓(xùn)練干預(yù)后，與衰老安靜組相比，30%、50%最大負(fù)重訓(xùn)練組大鼠腓腸肌Bcl-2/Bax mRNA比值的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）；與0%最大負(fù)重訓(xùn)練組比較，30%最大負(fù)重訓(xùn)練組Bcl-2/Bax mRNA比值的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而50%和70%最大負(fù)重訓(xùn)練組的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見表2）。結(jié)果表明，抗阻訓(xùn)練使凋亡調(diào)控基因Bcl-2/Bax mRNA比值上調(diào)，但以中、低強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練效果最為顯著。

表2 衰老安靜組與各抗阻訓(xùn)練組大鼠腓腸肌Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)及比值的比較Table2 The comparison of gastrocnemius Bcl-2，Bax mRNA expression among ratio of quiet aging group and each resistance training group

2.2 8周抗阻訓(xùn)練對(duì)衰老大鼠腓腸肌線粒體膜電位（ΔΨmt）的影響

經(jīng)過8周抗阻訓(xùn)練干預(yù)后，與衰老安靜組相比，各抗阻訓(xùn)練組大鼠腓腸肌線粒體膜電位（ΔΨmt）下降的細(xì)胞百分率均減少。其中，0%、30%、50%最大負(fù)重訓(xùn)練組的減少具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與0%最大負(fù)重訓(xùn)練組比較，30%最大負(fù)重訓(xùn)練組的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而50%和70%最大負(fù)重訓(xùn)練組的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見表3）。結(jié)果表明，抗阻訓(xùn)練可以不同程度地減少衰老大鼠腓腸肌線粒體ΔΨmt下降的細(xì)胞百分率，但以中、低強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練效果顯著。

表3 衰老安靜組與各抗阻訓(xùn)練組大鼠線粒體ΔΨmt下降的細(xì)胞百分率比較Table 3 The comparison of the percentage in cell reducing among aging control group’s mitochondrial membrane potential（ΔΨmt）and each resistance training group

線粒體膜電位見圖1。各圖中，右上象限為線粒體ΔΨmt正常的細(xì)胞百分率，即JC-1聚積于線粒體膜，而右下象限為線粒體ΔΨmt發(fā)生下降的細(xì)胞百分率，即JC-1釋放為單體。線粒體ΔΨmt下降的細(xì)胞百分率減少，即發(fā)生凋亡的細(xì)胞呈減少趨勢(shì)。

3 分析與討論

Bcl-2家族蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要有2種：（1）Bcl-2家族蛋白精確地改變線粒體膜的通透性；（2）Bcl-2家族蛋白能夠誘導(dǎo)MPTP開放。目前發(fā)現(xiàn)，Bcl-2家族有15個(gè)成員，按功能可分為抗凋亡（Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡（Bax、Bad、Bid等）2大家族[4]。這2大家族蛋白相互結(jié)合、彼此抑制，其比例決定著線粒體對(duì)調(diào)亡信號(hào)的感受性[5]。

目前己經(jīng)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)過程中與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白是Bcl-2和Bax，Bcl-2/Bax比值很大程度上決定了細(xì)胞的存活或凋亡[6]。當(dāng)Bax表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2的表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞的存活期則延長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡。因此，只有當(dāng)Bcl-2/Bax比值在適宜的范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞才能存活，Bcl-2 mRNA、Bax mRNA通過編碼Bcl-2/Bax蛋白發(fā)揮作用。

BAKER等[7]對(duì)35月齡F344×BN大鼠跖肌進(jìn)行研究，結(jié)果表明，跖肌中Bax與Bcl-2有所下降，且Bax/Bcl-2比值也下降了67%，這意味著促凋亡信號(hào)在增齡過程中減弱。SONG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，老年安靜組大鼠腓腸肌Bax表達(dá)水平顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)水平下調(diào)，且腓腸肌中Bax/Bcl-2比值隨增齡上調(diào)。金其貫[3]研究了不同負(fù)荷游泳訓(xùn)練對(duì)大鼠細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果也表明，大鼠骨骼肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)經(jīng)適量的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后增加，經(jīng)長(zhǎng)期的力竭訓(xùn)練后表達(dá)下降，繼而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。SIU等[9]發(fā)現(xiàn)，SD大鼠經(jīng)8周（5次/周）跑臺(tái)訓(xùn)練后，比目魚肌中Bcl-2 mRNA表達(dá)及其蛋白表達(dá)上調(diào)，而Bax mRNA表達(dá)及其蛋白表達(dá)卻有所下調(diào)，Bcl-2/Bax mRNA比值增大，表明運(yùn)動(dòng)后比目魚肌中DNA降解程度有所減弱。SONG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，12周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能增加衰老骨骼肌中的Bcl-2含量，但腓腸肌和比目魚肌中DNA的降解、Caspase-3、Bax以及Bax/Bcl-2比值卻均顯著下降。另有研究發(fā)現(xiàn)，劇烈運(yùn)動(dòng)后，Bcl-2/Bax的比值降低啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，但經(jīng)過一段時(shí)間休息后，Bcl-2/Bax值反而升高[10]。上述研究表明，衰老過程中Bcl-2/Bax比值均降低，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，但長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)或長(zhǎng)期有規(guī)律的訓(xùn)練可使Bcl-2/Bax比值增加，減弱細(xì)胞凋亡，從而減少肌肉丟失。

本研究結(jié)果表明，衰老大鼠經(jīng)8周抗阻訓(xùn)練干預(yù)后，與衰老安靜組相比，各抗阻訓(xùn)練組大鼠腓腸肌Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平及其Bcl-2/Bax mRNA比值出現(xiàn)不同程度的變化。其中，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平在30%和50%最大負(fù)重訓(xùn)練下的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）；Bax mRNA表達(dá)水平在30%和50%最大負(fù)重訓(xùn)練下的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）；Bcl-2/Bax mRNA比值在30%和50%最大負(fù)重訓(xùn)練下的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。說明，適宜負(fù)荷的抗阻訓(xùn)練能上調(diào)腓腸肌Bcl-2/Bax mRNA比值，減少細(xì)胞凋亡。由于抗凋亡蛋白Bcl-2和Bax競(jìng)爭(zhēng)性地與ANT結(jié)合，抑制Bax所介導(dǎo)的線粒體膜蛋白通道的形成，精確地調(diào)控線粒體膜的通透性，阻止MPTP的開啟，進(jìn)而調(diào)控線粒體ΔΨmt的變化。因此，Bcl-2/Bax mRNA比值的變化與線粒體膜電位有一定的聯(lián)系，本實(shí)驗(yàn)對(duì)線粒體ΔΨmt的測(cè)試結(jié)果也有力地證實(shí)了這一結(jié)論。在本實(shí)驗(yàn)中，各抗阻訓(xùn)練組大鼠線粒體ΔΨmt下降的細(xì)胞百分率出現(xiàn)減少，與衰老安靜組相比，0%、30%、50%最大負(fù)重訓(xùn)練組的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與0%最大負(fù)重訓(xùn)練組比較，30%最大負(fù)重訓(xùn)練組的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而50%和70%最大負(fù)重訓(xùn)練組的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說明，經(jīng)過8周抗阻訓(xùn)練能抑制衰老大鼠線粒體膜通透性升高和MPTP開放，從而抑制ΔΨmt下降，線粒體功能得到一定的改善，且其效果與負(fù)荷強(qiáng)度有關(guān)。這表明，8周抗組訓(xùn)練能改善衰老大鼠腓腸肌Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)水平，使Bcl-2/Bax mRNA比值升高，相應(yīng)地改善線粒體功能，提高線粒體ΔΨmt。但與之對(duì)應(yīng)的抗阻力訓(xùn)練組，大鼠腓腸肌Bcl-2/Bax mRNA比值的下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），而線粒體ΔΨmt下降的細(xì)胞百分率的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這也證實(shí)了影響線粒體功能的因素較多，比如Ca2+、活性氧、氧化應(yīng)激等。

4 結(jié) 論

8周不同負(fù)重抗阻訓(xùn)練能不同程度改善衰老大鼠腓腸肌凋亡調(diào)控基因的表達(dá)水平，上調(diào)Bcl-2/Bax比值，相應(yīng)地降低線粒體膜電位下降的細(xì)胞百分率，改善線粒體功能，且低、中等負(fù)重抗阻訓(xùn)練效果較好。

[1]VAUX D L.Toward and understanding of the molecular mechanism of physiological cell death[J].Proc Nat Acad Sci USA，1993，90：7865.

[2]ADAMSJM，CORY S.The Bcl-2 protein family：arbitersof cell survival[J].Science，1998，281（5381）：1322-1326.

[3]金其貫.慢性力竭性訓(xùn)練對(duì)大鼠骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響[J].體育與科學(xué)，1999，20（12）：23-29.

[4]FANG H.Bcl-2 gene family in apoptosis and skin carcinoma[J].Medical Sciences，2000，29（3）：141-144.

[5]CHAMIM，PRANDINI A，CAMPAELLA M，etal.Bcl-2 and Bax exert opposing effects on Ca2+signaling，which do not depend on their putative pore-formingregion[J].JBiol Chem，2004，279（52）：54581-54589.

[6]BELZACQA S，VIEIRA HL，VERRIERF，etal.Bcl-2 and Bax modulate adenine nucleotide translocase activity[J].Cancer Res，2003，63（2）：541-546.

[7]BAKER D J，HEPPLE R T.Elevated caspase and AIF gene expression correlatewith progression of sarcopenia during agingin male F344BNrats[J].Exp Gerontol，2006，41：1149-1156.

[8]SONG W，KWAK H B，LAWLER J M.Exereise training attenuates age-induced ehanges in apoptotic signaling in rat skeletal muscle[J].Antioxid Redox Signal，2006，8（3-4）：517-528.

[9]SIU PM，BRYNER R W，MARYN JK，etal.Apoptotic adaptations from exercisetrainingin skeletal and cardiac muscles[J].Faseb，2004，18（10）：1150-1152.

[10]PODHORSKA-OKOLOV M，SANDR I M，ZAMPIER I S，etal.Apoptosis of myofibers and satellite cells：exercise induced damage in skeletal muscleof themouse[J].Neuropatho Appl Neurobiol，1998，24（6）：518-531.