蘇 丹，宋永貴*，魏斌斌，范榮華

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西南昌 330006;2.沈陽藥科大學(xué)，遼寧沈陽 110016)

克咳膠囊由麻黃、罌粟殼、甘草、苦杏仁、萊菔子、桔梗、石膏共七味中藥組成，具有止咳、定喘、祛痰的功效，是被廣泛應(yīng)用的咳嗽類非處方中藥制劑，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》(第17冊)。麻黃和罌粟殼是方中君藥，所含鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿和嗎啡是主要有效成分［1-3］，具有一定成癮性和毒性，部頒標準中并沒有對其進行定量控制的方法。此外，鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿互為差向異構(gòu)體，在藥理活性上具有差異［4-5］，近年報道，鹽酸麻黃堿較鹽酸偽麻黃堿表現(xiàn)出更強的平喘效果［6］。因此，建立分離和測定克咳膠囊中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和嗎啡的方法，是提高制劑質(zhì)量控制水平的迫切需求，對增強其臨床應(yīng)用的有效性和安全性具有重要意義。

已有文獻報道采用HPLC法測定克咳膠囊中的鹽酸麻黃堿［7-8］，卻并未對其和鹽酸偽麻黃堿進行分離，因此未能實現(xiàn)該制劑中鹽酸麻黃堿的準確測定。由于二者互為差向異構(gòu)體，分離測定存在一定難度，常采用CE法［9-10］進行分離，在HPLC法或GC法中，也以衍生化法［11-12］或離子對試劑［13］多見，樣品處理過程或流動相條件繁瑣苛刻。本實驗采用高分離度快速液相色譜(Rapid Resolution Liquid Chromatography，RRLC)，經(jīng)過前期大量實驗摸索，最終建立流動相組成簡單、分離效果佳，且重復(fù)性好、分析時間短的克咳膠囊中3種主要生物堿鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和嗎啡同時定量測定方法，為更好地監(jiān)控制劑的生產(chǎn)以及保障產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Angilent 1290 Infinity RRLC型液相色譜儀(美國Agilent公司)，AR-5120天平(瑞士Metrler toledo公司)，MILLI-Q型超純水儀(美國Millipore公司)。乙腈(美國Fisher試劑公司)、乙酸(美國Sigma-Aldrich公司)、乙酸銨(美國Sigma-Aldrich公司)為色譜純，水為去離子水，其他所用試劑均為分析純。供含量測定用鹽酸麻黃堿對照品(批號:171241-201007)、鹽酸偽麻黃堿對照品(批號:171237-200806)、嗎啡對照品(批號:171201-200822)均購自中國藥品生物制品檢定所?？丝饶z囊(貴州益佰制藥股份有限公司，0.3 g/粒，批號為111215，120209，120417)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取在60℃減壓干燥2 h的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和嗎啡對照品15.3、13.62、12.86 mg，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密吸取1 mL混合對照品貯備液，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，制成鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、嗎啡質(zhì)量濃度分別為61.2、54.48、51.44μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品20粒，精密稱定，計算平均質(zhì)量。取內(nèi)容物0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，精密加入氨試液1 mL與三氯甲烷50 mL，稱定質(zhì)量，超聲45 min，放冷，再稱定其質(zhì)量，用三氯甲烷補足其減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密取續(xù)濾液5 mL，加入2%鹽酸無水乙醇溶液2 mL，搖勻，置水浴鍋上蒸干，殘渣加0.1%鹽酸溶液10 mL，超聲使之溶解完全，定容至10 mL量瓶中，用0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按處方比例分別除去麻黃和罌粟殼藥材的其他藥材適量，依照克咳膠囊制備工藝和供試品溶液的制備方法制得不含鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和嗎啡的溶液，作為陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 Angilent ZORBAX SB-C8色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8μm);流動相為乙腈-2 mmoL/L乙酸銨水溶液(含0.04%乙酸)(4∶96);體積流量0.2 mL/min;檢測波長為210 nm;柱溫30℃;進樣量5μL。在上述色譜條件下，樣品中的各組分達到基線分離，樣品中其他成分對鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和嗎啡的測定無干擾。對照品溶液、樣品及各陰性樣品的色譜圖見圖1。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取各對照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL，分別置 10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。取上述混合溶液各20μL進樣，在上述色譜條件下進行分析。用峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸，結(jié)果表明嗎啡、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的回歸方程分別為Y=46.65X+5.22(r=0.9992)、Y=20.67X－1.80(r=0.9997)、Y=18.64X －2.50(r=0.9994)。嗎啡、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的線性范圍分別為 3.06 ～ 48.96μg/mL，2.72 ～ 43.58μg/mL，2.57 ～41.15μg/mL。

2.3.2 精密度試驗 取嗎啡、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的混合對照品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)進樣6次，測定峰面積。嗎啡、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿峰面積的 RSD分別為1.87%、2.04%和1.72%。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10、12 h測定，結(jié)果表明，供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，嗎啡、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為2.11%、1.75%、和1.29%。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批號克咳膠囊內(nèi)容物0.5 g，共6份，精密稱定，按2.1.2項供試品制備項下方法操作，在上述色譜條件下進行分析測定，計算，嗎啡、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的RSD分別為2.70%、2.19%和1.27%。

2.3.5 回收率試驗 取已知含有量的克咳膠囊內(nèi)容物適量，研細，取約0.25 g共9份，精密稱定質(zhì)量，3份為1組，每3組按低、中、高分別精密加入相當(dāng)于樣品中嗎啡、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含有量的50%、100%、150%的對照品溶液，依2.1.2項下方法操作。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

2.4 樣品測定 取3批樣品，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，依照2.2項色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，按外標二點法計算各樣品中嗎啡、鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的量，見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Determination results of Keke Capsules(n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的確定 高分離度快速液相色譜(RRLC)技術(shù)的使用，極大地縮短了分析時間，使得本方法可以在15 min內(nèi)實現(xiàn)克咳膠囊中該3種生物堿的分離測定。但在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，由于克咳膠囊中該3種生物堿成鹽后極性很大，按照文獻中所報道HPLC色譜中常采用的C18色譜柱，無法在RRLC色譜中得到重現(xiàn)，在本實驗所考察的超高壓C18色譜柱Phenomenex Kinetex C18(50 mm×2.1 mm，1.7μm，) 和 Angilent ZORBAX SB-C18(100 mm×2.1 mm，1.8μm)上均較難獲得保留，最終選擇超高壓C8色譜柱(Angilent ZORBAX SBC8)，三者可以實現(xiàn)保留。

因麻黃堿與偽麻黃堿互為差向異構(gòu)體，實驗中發(fā)現(xiàn)在流動相中加入酸性溶液可以明顯增加二者在該色譜柱保留行為的差異性，實現(xiàn)拆分。但酸的存在，同時又造成了麻黃堿與偽麻黃堿色譜峰較嚴重的拖尾現(xiàn)象。因此，需要調(diào)節(jié)流動相合適的pH值以改善二者的色譜峰型，實驗考察了0.02%乙酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液，0.04%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液，0.04%乙酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液和0.08%乙酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液四種體系，發(fā)現(xiàn)后兩種作為水相流動相所獲峰型良好，可滿足測定要求。同時考慮到對色譜柱長期使用的保護，最終確定為0.04%乙酸-2 mmol/L乙酸銨水溶液(pH4.0)。

在上述確定的色譜柱和流動相條件下，嗎啡的色譜保留行為與鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿區(qū)別明顯，無需梯度洗脫，因此采用等度洗脫即可實現(xiàn)3者分離同時測定。

3.2 提取條件的確定 麻黃堿，偽麻黃堿與嗎啡的pka值為9.58，9.74和7.0，分別具有堿性和弱堿性，因此將樣品堿化后，采用三氯甲烷提取明顯增加了提取效率。實驗考察了甲醇、50%甲醇與氨試液-三氯甲烷提取，結(jié)果顯示，經(jīng)氨試液-三氯甲烷提取的樣品效率高，雜質(zhì)少。

3.3 小結(jié) 已有文獻中對克咳膠囊鹽酸麻黃堿量的測定，一直以來都有混淆，將鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿混為一體，影響了該制劑質(zhì)量評價的合理性、科學(xué)性，本實驗采用RRLC-UV法對鹽酸麻黃堿，鹽酸偽麻黃堿和嗎啡這3種有效成分進行分離測定，實現(xiàn)了對克咳膠囊質(zhì)量控制方法的提升。

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