王金林，王 寧，，張俊松，王曉利*，王 蕭

(1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東深圳 518055;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，廣東廣州 510006)

光動力療法(Photodynamic therapy)是指光敏劑(Photosensitizer)被人體攝入后選擇性地積累在腫瘤組織內(nèi)，在特定的光源激發(fā)下，由基態(tài)變成激發(fā)態(tài)，從而引發(fā)一系列的光化學(xué)和光生物學(xué)反應(yīng)，最終導(dǎo)致腫瘤組織壞死的一種療法。光動力治療可與傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療聯(lián)合使用，具有腫瘤靶向性、低毒性、可重復(fù)治療等優(yōu)點［1］。目前光動力療法技術(shù)在加拿大、美國、法國、荷蘭、德國、日本等很多國家已批準(zhǔn)使用。

光敏劑是光動力療法治療最主要的因素。金絲桃素(Hypericin)為萘駢二蒽酮類化合物，存在于貫葉金絲桃Hypericum perforatum L.及同屬植物，是自然界已知的最有效的光敏劑之一。金絲桃素的抗腫瘤作用應(yīng)用研究很廣泛，涉及肝癌、垂體瘤、卵巢癌、膠質(zhì)瘤、皮膚癌等［2-4］。本研究組多年來對金絲桃素-光動力療法治療腫瘤做了大量的研究，發(fā)現(xiàn)金絲桃素純品光動力療法對人肝癌細胞(HepG2)［5］、鼻咽癌細胞(CNE-2)［6-7］、人乳腺癌細 胞 (MDA231)［8］、肺癌細胞(SpcA1、A549)［9-10］等都有生長抑制作用。本實驗研究了不同純度金絲桃素提取物對鼻咽癌細胞CNE-2的光動力效應(yīng)，并將效果最佳的提取物應(yīng)用于移植性鼻咽癌的光動力治療。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞系 SPF級BALB/c裸鼠:3～4周齡，雄性，共40只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號:2007000507031。人鼻咽癌細胞株(CNE-2)購自中山大學(xué)實驗動物中心細胞庫。

1.2 試劑和儀器 金絲桃素提取物(實驗室自制，從貫葉金絲桃中提取，高、中、低純度分別為66.4%、33.0%、3.2%);金絲桃素純品(瑞士Alexis公司，批號:L23850);血卟啉(重慶市華鼎現(xiàn)代生物制藥有限責(zé)任公司);RPMI 1640培養(yǎng)基干粉(美國Gibco公司);四甲基偶氮唑藍(MTT，美國Sigma公司);水合氯醛干粉(天津市密歐化學(xué)試劑研發(fā)中心);其余試劑均為分析純。

LED光源(定制于深圳市佳進光電技術(shù)有限公司，黃色光波長范圍587～596 nm，紅色光波長范圍625～630 nm);酶標(biāo)儀(Thermo Scientific);數(shù)顯振蕩器(德國IKA);倒置顯微鏡(德國Leica)。

1.3 方法

1.3.1 體外光動力效應(yīng) 取對數(shù)生長期CNE-2細胞，調(diào)整細胞密度1×105個/mL，接種于96孔板，每孔0.1 mL，置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞覆蓋率為70%左右。給藥組加入各質(zhì)量濃度金絲桃素提取物或金絲桃素純品溶液，每個質(zhì)量濃度重復(fù)8個孔，設(shè)空白對照組(只加0.1%DMSO溶液)。孵育6 h后，用主波長為590 nm的LED黃光照射，光源距離培養(yǎng)板上方2 cm，照射90 min，積累能量約5.67 J/cm2。繼續(xù)培養(yǎng)20 h，吸出培養(yǎng)基，每孔加入用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基溶解的MTT溶液(0.5 mg/mL)0.1 mL。繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h，吸出MTT溶液，加入DMSO和無水乙醇混合溶液(1∶1)，每孔150μL。振蕩器震蕩15 min(避光)，酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處OD值。

1.3.2 體內(nèi)光動力治療 裸鼠隔離一周左右建模。取對數(shù)生長期的CNE-2細胞，PBS洗滌2次，調(diào)整細胞密度為2×107個/mL，接種于裸鼠右上肢腋下，每只0.15 mL。接種后第7天選擇瘤直徑0.3 cm左右、無自發(fā)性出血壞死、瘤周無感染病灶的裸鼠28只，為實驗?zāi)Ｐ?。隨機分為4組:高劑量組(5 mg/kg，光照)、低劑量組(2.5 mg/kg，光照)，血卟啉組(5 mg/kg，光照)，陰性對照組(空白溶液，光照)，每組7只。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，瘤周皮下局部給藥。避光6 h后進行光照，高劑量組、低劑量組、陰性對照組采用LED黃光照射(功率45 mW/個，距離光源2 cm處光斑聚焦直徑約2 cm，電壓1.9～2.2 V/個)。血卟啉組采用LED紅光照射(功率 45 mW/個，距離光源2 cm處光斑聚焦直徑約2 cm，電壓1.9～2.2V/個)(見圖1)。所有組光照3 h，光通量密度約 14 mW/cm2［11］，累計光量 155 J/cm2。

圖1 LED激發(fā)光源Fig.1 LED excitation source

給藥后，每天電子顯示游標(biāo)卡尺測量裸鼠腫瘤長徑a和短徑 b，根據(jù)測量結(jié)果計算腫瘤體積(V=a×b2×π/6)。計算相對腫瘤體積(VT/V0)，其中V0為開始給藥時測量的腫瘤體積，VT為給藥后測量的腫瘤體積。相對腫瘤增殖率計算為V治療組/V對照組×100%，其中 V治療組為治療組相對腫瘤體積，V對照組為對照組相對腫瘤體積。

2 結(jié)果

2.1 不同提取物光動力效應(yīng)比較 當(dāng)金絲桃素質(zhì)量濃度分別為0.2、0.15μg/mL時，高純度金絲桃素提取物、中純度金絲桃素提取物、低純度金絲桃素提取物以及金絲桃素純品均顯示了對CNE-2細胞不同程度的光動力效應(yīng)。在金絲桃素質(zhì)量濃度一致的情況下，高純度金絲桃素提取物對CNE-2細胞的增殖抑制率最高，其抑制率高于金絲桃素純品。中純度金絲桃素提取物和低純度金絲桃素提取物對CNE-2細胞的增殖抑制率較低，見表1，CNE-2細胞光動力治療后的細胞形態(tài)見圖2。

表1 金絲桃素純品及不同純度金絲桃素提取物對CNE-2細胞的光動力效應(yīng)(，n=8)Tab.1 Photodynamic effect of pure hypericin and different purity of hypericin extracts on CNE-2 cells(，n=8)

表1 金絲桃素純品及不同純度金絲桃素提取物對CNE-2細胞的光動力效應(yīng)(，n=8)Tab.1 Photodynamic effect of pure hypericin and different purity of hypericin extracts on CNE-2 cells(，n=8)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

金絲桃素/(μg·mL-1) 樣品 OD值()抑制率/%0.20 純品 0.339±0.037 71.4＊＊- 1.185±0.103 -0.20 高純度 0.158±0.036 86.6＊＊0.20 中純度 0.669±0.056 43.5＊＊0.20 低純度 0.720±0.061 39.3＊＊0.15 純品 0.412±0.039 65.2＊＊0.15 高純度 0.296±0.023 75.0＊＊0.15 中純度 1.038±0.055 12.4*0.15 低純度 1.023±0.153 13.6*對照組

圖2 細胞形態(tài)Fig.2 Morphous of CNE-2 cells

2.2 高純度金絲桃素提取物的半數(shù)抑制濃度MTT法檢測不同質(zhì)量濃度的高純度金絲桃素提取物對CNE-2細胞的增殖抑制作用，通過抑制率對藥物質(zhì)量濃度作Probit回歸分析，得到高純度金絲桃素提取物對CNE-2細胞的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為(0.093±0.004)μg/mL(表2)。結(jié)果說明，CNE-2細胞對高純度金絲桃素提取物敏感，呈劑量依賴關(guān)系，可進一步進行體內(nèi)實驗研究。

表2 不同質(zhì)量濃度高純度金絲桃素提取物對CNE-2細胞的光動力效應(yīng)(，n=8)Tab.2 Photodynamic effect of different concentrations of high purity of hypericin extract on CNE-2 cells(，n=8)

表2 不同質(zhì)量濃度高純度金絲桃素提取物對CNE-2細胞的光動力效應(yīng)(，n=8)Tab.2 Photodynamic effect of different concentrations of high purity of hypericin extract on CNE-2 cells(，n=8)

注:與對照組比較，＊＊P＜0.01

高純度金絲桃素/(μg·mL-1) 抑制率/% IC50/(μg·mL-1)0.20 90.0±1.8＊＊0.16 79.3 ±1.6＊＊0.12 64.5 ±2.0＊＊ 0.093 ±0.0040.08 51.8 ±1.2＊＊0.04 2.7±3.9空白對照組-

2.3 高純度金絲桃素提取物體內(nèi)光動力治療 以第6天的相對腫瘤增殖率作療效評價。3個實驗組(高劑量高純度金絲桃素提取物、低劑量高純度金絲桃素提取物、陽性對照組)的腫瘤相對增值率分別為38.8%、59.7%、56.3%(表3)。3組相對腫瘤體積與陰性對照組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。高純度金絲桃素提取物高劑量組的相對腫瘤體積與血卟啉對照組也有極顯著性差異(P＜0.01)。高純度金絲桃素提取物高劑量治療后第3天CNE-2實體瘤有明顯的壞死，第6天可見深部壞死;血卟啉治療后第3天CNE-2實體瘤并不見明顯的壞死，在第6天可見表面壞死(圖3)。實驗結(jié)果表明高純度金絲桃素提取物有抑制鼻咽癌腫瘤生長的作用。

表3 高純度金絲桃素提取物體內(nèi)光動力治療效果(，n=7)Tab.3 Photodynamic effect of high purity of hypericin extract in vivo(，n=7)

表3 高純度金絲桃素提取物體內(nèi)光動力治療效果(，n=7)Tab.3 Photodynamic effect of high purity of hypericin extract in vivo(，n=7)

注:與陰性對照組比較，＊＊P＜0.01

組 別 腫瘤體積/mm3 0 d 6 d相對腫瘤體積相對增殖率/%高劑量組 210.9±34.0 500.1±177.9＊＊ 2.44±0.93＊＊38.2低劑量組 234.7±49.7 849.6±247.3＊＊ 3.81±0.90＊＊ 59.7血卟啉組 288.8±52.81087.8±163.0＊＊ 3.60±0.36＊＊ 56.3陰性對照組249.2±89.81408.7±245.5 6.39±1.85 -

圖3 腫瘤生長觀察Fig.3 Growth of tumor

3 討論

金絲桃素是一種高效的光敏劑，Kiesslich等［12］指出金絲桃素擁有高的三線態(tài)量子產(chǎn)量，并高效產(chǎn)生單線態(tài)氧和超氧離子。金絲桃素在光動力學(xué)治療中表現(xiàn)出強誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡活性。Luksiene等［13］研究表明金絲桃素-光動力療法對艾式腹水瘤的抑制作用優(yōu)于血卟啉二甲醚、卟吩姆鈉Ⅱ、α，β，γ，δ-四(對磺苯基)卟吩、5-氨基乙酰丙酸等光敏劑。H?pfner等［14］證實金絲桃素-光動力療法對食管癌細胞的IC50值遠小于5-氨基乙酰丙酸-光動力療法。Boiy A［15］等人研究表明，金絲桃素作為光敏劑其抗腫瘤作用優(yōu)于甲基-氨基乙酰丙酸。因此，金絲桃素是極有潛力的光動力治療腫瘤藥物。目前，美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)金絲桃素用于治療腦腫瘤(膠質(zhì))及皮膚T細胞淋巴瘤。以色列海蘭生物制藥2008年5月公布，以金絲桃素為基礎(chǔ)的生物制劑將投入腦癌治療的三期臨床研究［16］。海蘭生物制藥預(yù)計，金絲桃素將在3年內(nèi)成為臨床上獲得批準(zhǔn)的藥物來治療皮膚T細胞淋巴癌，并在5年內(nèi)用于治療膠質(zhì)瘤。2010年Rook等［17］報道了金絲桃素治療皮膚T細胞鱗癌的二期臨床試驗。

由于貫葉金絲桃全草中的金絲桃素的量只有萬分之幾，且化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、熱和氧易分解，分離純化得到高純度金絲桃素困難。因此選用金絲桃素提取物作為光動力藥物或許是一種可行的辦法。同時有研究表明，相對于使用金絲桃素純品，使用含有金絲桃素的貫葉金絲桃提取物會有較少的光毒性，這可能是由于貫葉金絲桃的其它抗氧化劑成分的作用，例如:黃酮類、卟啉、酚酸等，這些成分可能通過減少金絲桃素激活產(chǎn)出的活性氧，而降低氧化引起的破壞［18］。英國 Wilhelm等［19］評價了3種貫葉金絲桃提取物對人角質(zhì)細胞的光毒性，在所試驗的黃酮類化合物中，槲皮苷對抑制貫葉金絲桃提取物的光毒性反應(yīng)非常有效，因此提出在制備貫葉金絲桃提取物時應(yīng)當(dāng)保留黃酮類成分尤其是槲皮苷。

本實驗考察了不同純度金絲桃素提取物對CNE-2細胞的光動力效應(yīng)，當(dāng)金絲桃素純度較低時，對CNE-2細胞的增殖抑制率較低。但是，當(dāng)純度進一步提高到66.4%時，對CNE-2細胞的殺傷效應(yīng)顯著提高，其IC50為(0.093±0.004)μg/mL，且高于金絲桃素純品。因此，高純度金絲桃素提取物內(nèi)存在的其它黃酮類物質(zhì)可能對金絲桃素-光動力療法鼻咽癌具有協(xié)同效應(yīng)。同時體內(nèi)藥效學(xué)實驗也證明了高純度金絲桃素提取物對移植性鼻咽癌有很好的光動力效應(yīng)，且在同等劑量下其光動力效應(yīng)優(yōu)于陽性對照藥—血卟啉。因此，高純度金絲桃素提取物可以用于進一步的藥學(xué)研究。

但是，高純度金絲桃素提取物體內(nèi)藥效學(xué)實驗時，通過對腫瘤生長情況的觀察可知高純度金絲桃素提取物對裸鼠皮膚仍有一定的皮膚光毒性。因此在應(yīng)用高純度金絲桃素提取物治療腫瘤時，應(yīng)注意避光。同時如何降低高純度金絲桃素提取物的光毒性有待進一步深入研究。

［1］曾霞波，虞樂華，許川山.光動力學(xué)療法的研究概況及其展望［J］.激光雜志，2006，27(6):91-92.

［2］Seitz G，Krause R，F(xiàn)uchs J，et al.In vitro photodynamic therapy in pediatric epithelial liver tumors promoted by hypericin［J］.Oncol Rep，2008，20(5):1277-1282.

［3］Cole C D，Liu J K，Sheng X M，et al.Hypericn-mediated photodynamic therapy of pituitary tumors:preclinical study in a GH4C1 rat tumor model［J］.J Neurooncol，2008，87:255-261.

［4］Zeisser Labouèbe M，Lange N，Gurny R，et al.Hypericn-loaded nanoparticles for the photodynamic treatment of ovarian cancer［J］.Int J Pharm，2006，326(1-2):174-181.

［5］王曉利，張俊松，劉金釧，等.金絲桃素對HepG2細胞的體外殺傷效應(yīng)研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(1):69-71.

［6］Wang Xiaoli，Guo Yi，Yang Shu，et al.Cell and molecular mechanisms of photodynamic hypericin therapy for nasopharyngeal carcinoma cells［J］.JPET，2010，334(3):847-853.

［7］王曉利，王彩虹，郭 懿，等.光誘導(dǎo)金絲桃素對人鼻咽癌細胞CNE-2的毒作用和凋亡研究［J］.中成藥，2010，32(8):1296-1300.

［8］王曉利，張俊松，劉金釧，等.金絲桃素提取物對乳腺癌細胞MDA231的光動力殺傷效應(yīng)研究［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2008，25(1):1-4.

［9］王曉利，劉金釧，張俊松，等.金絲桃素及提取物對肺癌細胞SpcA1的體外殺傷效應(yīng)［J］.中國藥業(yè)，2008，27(13):13-14.

［10］王曉利，張俊松，劉金釧，等.貫葉金絲桃中金絲桃素提取物對人肺癌細胞A549的體外殺傷效應(yīng)［J］.中成藥，2007，29(7):1058-1061.

［11］Boiy A，Roelandts R，van den Oord J，et al.Photosensitizing activity of hypericin and hypericin acetate after topical application on normal mouse skin［J］.Photobiology，2008，158:360-369.

［12］Kiesslich T，Krammer B，Plaetzer K.Cellular mechanisms and prospective applications of hypericin in photodynamic therapy［J］.Curr Med Chem，2006，13:2189-2204.

［13］Luksiene Z，Witte P A.Hypericin as novel and promising photodynamic therapy tool:studies on intracellular accumulation capacity and growth inhibition［J］.Medicina(Kaunas)，2003，39(7):677-682.

［14］H?pfner M，Maaser K，Theiss A，et al.Hypericin activated by an incoherent light source has photodynamic effects on esophageal cancer cells［J］.Int J Colorectal Dis，2003，18(3):239-247.

［15］Boiy A，Roelandts R，Van den Oord J，et al.Photosensitizing activity of hypericin and hypericin acetate after topical application on normal mouse skin［J］.Photobiology，2008，158:360-369.

［16］Weinreb Gali.Hy BioPharma innovating with photodynamic therapeutics［J］.Start-UP，2008，13(7):20-21.

［17］Rook A H，Wood GS，Duvic M，et al.A phase II placebo-controlled study of photodynamic therapy with topical hypericn and visible light irradiation in the treatment of cutaneous T-cell lymphoma and psoriasis［J］.Jam Acad Dermatol，2010，63(6):984-989.

［18］Schmitt L A，Liua Y，Murphya P A，et al.Reduction in hypericin-induced phototoxicity by Hypericum perforatum extracts and pure compounds［J］.J Photochem Photobiol B，2006，85(2):118-130.

［19］Wilhelm K P，Biel S，Siegers C P.Role of flavonoids in controlling the phototoxicity［J］.Phytomedicine，2001，8(4):306-309.