劉 琳，蓋祥云，趙 瑛

（哈爾濱商業(yè)大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

血管性認知功能障礙是由血管因素導致或與之伴隨的認知功能損害［1］。近年來，關于腦缺血后細胞凋亡的研究已成為許多學者關注的熱點［2-3］。雖然許多研究都已證明海馬神經元細胞凋亡與認知功能障礙的產生密切相關［4］，但多是針對凋亡產生機制的研究，而關于血管性認知功能障礙產生的過程中海馬神經元蛋白的動態(tài)變化規(guī)律的研究卻鮮有報道。因此本實驗著重研究和動態(tài)觀察血管性認知功能障礙發(fā)病過程與海馬神經元細胞蛋白Cyto C、Bcl-2、Bax之間的關系，為開發(fā)具有針對性的血管性認知功能障礙預防用藥提供實驗方法。為此，本實驗選用雙側頸總動脈結扎法建立血管性認知功能障礙模型，通過免疫組化法檢測腦組織蛋白細胞色素C(Cyto C)、Bcl-2、Bax的表達，探討血管性認知功能障礙發(fā)病過程與細胞蛋白變化之間的關系。同時，使用改善大鼠學習記憶功能的藥物——芎麻滴丸進行預防用藥，研究其對蛋白Cyto C、Bcl-2、Bax表達的影響，探討預防血管性認知功能障礙的作用機制。

1 材料

1.1 動物 成年健康SD雄性大鼠 (12～14周齡)120只，體質量為300 g～350 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。合格證號:SCXK(黑)2009-10。

1.2 藥品及試劑 芎麻滴丸成型前液體:哈爾濱商業(yè)大學藥學院實驗室制備 (川芎總酚酸和天麻總苷質量分數(shù)≥37.77%)。濃縮制成相當于1 g/mL生藥的溶液，保存于4℃冰箱備用。銀杏葉片 (產品批號:0907081)購自廣西億康藥業(yè)股份有限公司；Cyto C兔抗大鼠多克隆抗體 (產品批號:09K01)、Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗體 (產品批號:09L02)均購自武漢博士德生物工程有限公司；Bax兔抗大鼠多克隆抗體 (產品批號:09X01)購自中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 儀器 Leica RM2135石蠟切片機 (德國萊卡公司)；光學顯微鏡 (日本Olympus BH-2型)。

2 方法

2.1 血管性認知功能障礙模型的建立 采用永久性結扎雙側頸總動脈的方法建立血管性認知功能障礙大鼠模型［5］，將大鼠術前12 h禁食、4 h禁水。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切開，分離暴露左、右側頸總動脈，套以0號絲線雙重結扎，逐層縫合。假手術組大鼠除不結扎頸總動脈，其余同手術組。術中大鼠肛溫保持在36.5～37.5℃，術畢給予注射青霉素鈉水溶液適量局部涂敷，放入籠中飼養(yǎng)，每日肌注青霉素鈉2×105U/只，連用3 d，防治感染。

2.2 實驗動物分組及給藥 按照動物體質量及跳臺成績將動物隨機分為模型組 (生理鹽水10 mL/kg)、芎麻滴丸高劑量組 (相當于生藥1.5 g/kg)、中劑量組 (相當于生藥0.75 g/kg)、低劑量組 (相當于生藥0.375 g/kg)［7］、銀杏葉片組 (61.359 mg/kg)，另加假手術組 (生理鹽水10 mL/kg)，共6組。每組動物又分別分為4個亞組，即造模后7 d、14 d、28 d、42 d(每組5只)。于模型建立前3 d開始灌胃給藥，每天灌胃兩次，給藥持續(xù)至動物處死當天。

2.3 免疫組化法分別檢測大鼠海馬中Cyto C、Bcl-2及Bax的量 按兔二步法免疫組化試劑盒操作，3%H2O2孵育10 min，蒸餾水洗3次?？乖邏簾嵝迯? min。冷卻至室溫，0.01 mol/L PBS洗5 min，共3次。分別滴加Cyto C兔抗大鼠多克隆抗體 (1∶50)；Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗體 (1∶50)；Bax兔抗大鼠多克隆抗體 (1∶50)，陰性對照采用PBS代替一抗，4℃過夜。PBS洗三次每次5 min。滴加生物素化二抗，20℃ ～37℃ 20 min。PBS洗3次每次5 min。DAB顯色，蘇木素復染，封片，鏡檢。免疫組化陽性細胞顯色棕黃色或棕褐色，采用BI-2000免疫組化圖像分析系統(tǒng)選擇 (400×)10個不同視野進行平均光密度值分析，取其平均值為該樣本平均光密度值。

2.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS 17.0 For Windows統(tǒng)計軟件中單因素方差分析進行多組間比較，計量結果均以平均值±標準差表示。P＜0.05為有顯著性差異；P＜0.01為有非常顯著性差異。

3 結果

3.1 各組大鼠腦組織海馬區(qū)Cyto C陽性表達 Cyto C免疫組化結果顯示，造模 7 d、14 d、28 d、42 d，模型組海馬區(qū)大量神經元細胞胞漿中均出現(xiàn)黃色或者棕黃色表達，芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組均可不同程度地降低陽性表達。與假手術組相比，模型組動物在造模7 d、14 d、28 d、42 d時的Cyto C陽性表達顯著升高 (P＜0.01)，且以14 d和28 d升高更為明顯 (P＜0.01)；與模型組相比，芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組動物在造模7 d、14 d、28 d、芎麻滴丸低、中劑量組動物早造模42 d時的Cyto C陽性表達顯著降低 (P＜0.01)，且以7 d時降低Cyto C表達作用更為明顯 (P＜0.01)。結果見表1。

表1 各組大鼠腦組織海馬Cyto C陽性表達結果(，n=5)

表1 各組大鼠腦組織海馬Cyto C陽性表達結果(，n=5)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與7 d比較，▲P＜0.05；與14 d比較，△P＜0.05。

組別 劑量/(mg·kg－1)7 d 14 d 28 d 42 d假手術組 — 0.040±0.003 0.046±0.003 0.049±0.002 0.048±0.002模型組 — 0.273±0.035＊＊ 0.370±0.034＊＊▲ 0.305±0.044＊＊ 0.234±0.039＊＊△芎麻滴丸低劑量組 375 0.112±0.006## 0.196±0.037##▲ 0.222±0.021##▲ 0.182±0.003##▲芎麻滴丸中劑量組 750 0.131±0.024## 0.258±0.021##▲ 0.193±0.025##▲ 0.192±0.019##▲芎麻滴丸高劑量組 1500 0.135±0.002## 0.268±0.016##▲ 0.212±0.029##▲ 0.233±0.016▲陽性對照組 61.359 0.118±0.010## 0.233±0.014##▲ 0.212±0.019##▲ 0.233±0.021▲

3.2 各組大鼠腦組織海馬區(qū)Bcl-2陽性表達 Cyto C免疫組化結果顯示，假手術組大鼠腦組織海馬內可見大量胞漿著色為黃色或者棕黃色的神經元細胞，在造模7 d、14 d、28 d、42 d時，模型組大鼠腦組織海馬內可見少量胞漿著色為淺黃色的神經元細胞，芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組可不同程度的提高蛋白表達。與假手術組相比，7 d、14 d、28 d、42 d模型組Bcl-2陽性表達均顯著降低(P＜0.01)；與模型組相比，7 d、14 d、28 d和42 d芎麻滴丸低劑量組Bcl-2陽性表達顯著升高 (P＜0.01)，7 d、28 d和42 d芎麻滴丸中劑量組Bcl-2陽性表達顯著升高(P＜0.01)，7 d、14 d銀杏葉片組Bcl-2陽性表達顯著升高(P＜0.01)。結果見表2。

3.3 各組大鼠腦組織海馬區(qū)Bax陽性表達 Bax免疫組化結果顯示，假手術組大鼠腦組織海馬區(qū)可見少量胞漿著色弱陽性的神經細胞。7 d、14 d、28 d、42 d模型組大鼠腦組織海馬區(qū)均可見大量胞漿著色強陽性的神經細胞；與模型組相比，芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組均可不同程度的降低大鼠腦組織海馬Bax陽性表達。與模型組相比，7 d、14 d、28 d、42 d芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組 陽性表達顯著降低 (P＜0.05，P＜0.01)。結果見表3。

表2 各組大鼠腦組織海馬Bcl-2陽性表達結果 (，n=5)

表2 各組大鼠腦組織海馬Bcl-2陽性表達結果 (，n=5)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組 別 劑量/(mg·kg－1)7 d 14 d 28 d 42 d假手術組 — 0.339±0.008 0.345±0.004 0.337±0.014 0.340±0.003模型組 — 0.229±0.019＊＊ 0.281±0.012＊＊ 0.244±0.016＊＊ 0.270±0.017＊＊芎麻滴丸低劑量組 375 0.284±0.025## 0.327±0.012## 0.280±0.023## 0.294±0.018##芎麻滴丸中劑量組 750 0.262±0.026## 0.282±0.034 0.268±0.028## 0.281±0.024##芎麻滴丸高劑量組 1500 0.231±0.038 0.279±0.036 0.253±0.035 0.272±0.018陽性對照組 61.359 0.259±0.005## 0.294±0.013##0.276±0.017 0.284±0.014

表3 各組大鼠腦組織海馬Bax陽性表達結果 (，n=5)

表3 各組大鼠腦組織海馬Bax陽性表達結果 (，n=5)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組 別 劑量/(mg·kg－1)7 d 14 d 28 d 42 d假手術組 — 0.165±0.021 0.171±0.021 0.171±0.036 0.165±0.027模型組 — 0.217±0.022＊＊ 0.314±0.021＊＊ 0.326±0.036＊＊ 0.209±0.038＊＊芎麻滴丸低劑量組 375 0.145±0.040## 0.229±0.026## 0.235±0.032## 0.180±0.038##芎麻滴丸中劑量組 750 0.173±0.026## 0.182±0.035## 0.236±0.028## 0.191±0.053##芎麻滴丸高劑量組 1500 0.194±0.021# 0.234±0.025## 0.249±0.049## 0.190±0.023#陽性對照組 61.359 0.200±0.019# 0.187±0.016## 0.238±0.024## 0.232±0.020#

與假手術組相比，7 d、14 d、28 d、42 d模型組陽性表達均顯著降低 (P＜0.01)；與模型組相比，7 d芎麻滴丸低、中劑量組和銀杏葉片組Bcl-2/Bax顯著升高 (P＜0.01)；14 d、28 d芎麻滴丸低、中、高劑量組和銀杏葉片組Bcl-2/Bax顯著升高 (P＜0.05，P＜0.01)；42 d芎麻滴丸低、中劑量組Bcl-2/Bax顯著升高 (P＜0.01)。結果見表4。

表4 各組大鼠腦組織海馬Bcl-2/Bax結果 (，n=5)

表4 各組大鼠腦組織海馬Bcl-2/Bax結果 (，n=5)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組 別 劑量 (mg·kg－1)7 d 14 d 28 d 42 d假手術組 —2.055±0.38 2.02±0.19 1.97±0.39 2.06±0.11模型組 — 1.06±0.20＊＊ 0.89±0.19＊＊ 0.75±0.21＊＊ 1.29±0.26＊＊芎麻滴丸低劑量組 375 1.96±0.46## 1.43±0.40## 1.19±0.37## 1.63±0.47##芎麻滴丸中劑量組 750 1.51±0.43## 1.55±0.45## 1.14±0.32## 1.47±0.41##芎麻滴丸高劑量組 1500 1.19±0.49 1.19±0.51# 1.02±0.41# 1.43±0.56陽性對照組 61.359 1.30±0.26## 1.57±0.40## 1.16±0.32##1.22±0.29

4 討論

血管性認知功能障礙是由血管因素導致或與之伴隨的認知功能損害，許多研究也表明慢性腦缺血血流減少是導致血管性認知功能障礙的重要因素。經過多年研究實踐，雙側頸總動脈結扎法建立腦缺血動物模型已被廣泛采用，已有研究表明模型制作6周后，大鼠出現(xiàn)明顯的認知功能障礙［6］。本研究發(fā)現(xiàn)采用雙側頸總動脈結扎法法建立大鼠血管性認知功能障礙模型7 d后即出現(xiàn)了Cyto C高表達，Bcl-2/Bax降低。隨著時間的延長，在模型建立后的14 d及28 d時，Cyto C高表達及Bcl-2/Bax降低達到高峰，此后有所恢復。本課題組同期研究表明:雙側頸總動脈結扎法法建立大鼠血管性認知功能障礙模型后28 d，海馬神經元細胞凋亡也達到高峰，這一結果提示腦缺血會引起線粒體膜通透性增強，使得Cyto C釋放，而造成海馬CA1區(qū)神經元細胞發(fā)生凋亡。

芎麻滴丸是傳統(tǒng)中藥復方芎麻湯經現(xiàn)代工藝提取分離并純化的中藥復方現(xiàn)代制劑，前期實驗表明芎麻滴丸可以改善雙側頸總動脈結扎法所致的大鼠學習記憶障礙［7］。而在預實驗中發(fā)現(xiàn)，本實驗所選用劑量為芎麻滴丸改善學習記憶障礙的最佳劑量，而中劑量為人體折算劑量。本研究發(fā)現(xiàn)，芎麻滴丸可以改善大鼠腦缺血后所產生的Cyto C高表達和Bcl-2/Bax降低，其中以芎麻滴丸低、中劑量效果最為顯著，與前期研究結果一致［7］。結果提示芎麻滴丸可能是通過線粒體途徑，抑制Cyto C，增加Bcl-2/Bax，抑制細胞凋亡而發(fā)揮預防血管性認知功能障礙的作用。

本研究結果同時還發(fā)現(xiàn)，芎麻滴丸及銀杏葉片在抑制Cyto C高表達的過程中以7 d組效果最為顯著，這很可能是由于藥物無法拮抗腦缺血14 d時Cyto C的過度高表達而造成的，而在芎麻滴丸升高Bcl-2/Bax的過程中卻不存在這樣的現(xiàn)象。此結果提示芎麻滴丸可能還會通過其他途徑增加血管性認知功能障礙大鼠腦內Bcl-2/Bax，從而抑制細胞凋亡而發(fā)揮預防作用。

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