趙 蓉， 李多偉， 任 濤， 林 芳， 林道發(fā)

(1.陜西省環(huán)境科學(xué)研究院，陜西西安 710061;2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069)

DNS比色法測(cè)定白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑活性的方法研究

趙 蓉1， 李多偉2*， 任 濤2， 林 芳2， 林道發(fā)2

(1.陜西省環(huán)境科學(xué)研究院，陜西西安 710061;2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069)

目的 建立DNS比色法測(cè)定從白蕓豆中分離純化α－淀粉酶抑制劑活性的方法。方法 通過(guò)測(cè)定波長(zhǎng)、DNS的用量及顯色反應(yīng)時(shí)間的試驗(yàn)，確定研究方法。結(jié)果 確定最佳條件為檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm，α－淀粉酶抑制劑與等量α－淀粉酶溶液37℃預(yù)溫15 min，加入2%可溶性淀粉溶液，準(zhǔn)確反應(yīng)5 min。再加入DNS試劑2 mL，沸水浴5 min后流水冷卻。該方法平均回收率為99.95%(n=9)，精密度實(shí)驗(yàn)RSD=1.01%。結(jié)論 該方法具有簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性良好等特點(diǎn)。適用于常規(guī)α－淀粉酶抑制劑的活性測(cè)定。

白蕓豆;DNS比色法;α－淀粉酶抑制劑活性

α－淀粉酶抑制劑 (α－amylase inhibitor，簡(jiǎn)稱 α－AI)，屬于糖苷水解酶。α－AI能抑制胃腸道內(nèi)唾液、胰淀粉酶的活性，阻礙或延緩人體對(duì)食物中主要的碳水化合物的水解和消化，降低食物中淀粉糖類物質(zhì)的分解吸收，起到降低血糖、血脂的作用，抑制血糖濃度的升高，從而有利于糖尿病患者的飲食治療。對(duì)于肥胖患者，可減少糖向脂肪轉(zhuǎn)化，延緩腸道排空，增加脂肪消耗以減輕體質(zhì)量［1］，國(guó)外已將α－淀粉酶抑制劑作為減肥保健食品進(jìn)行應(yīng)用［2－3］。因此，α－AI可以用來(lái)防治肥胖癥、脂肪過(guò)多癥、動(dòng)脈硬化癥、高血脂及糖尿病等疾病。α－AI還可以制成生物農(nóng)藥或作為抗蟲(chóng)基因，改良植物抗蟲(chóng)性［4］。在酶學(xué)研究方面，α－AI可作為探究 α－淀粉酶活性部位的分析工具，作為通過(guò)選擇作用測(cè)定α－淀粉酶同工酶的反應(yīng)物［5］。一些特異性抑制谷物萌發(fā)過(guò)程中合成的α－AI，也將會(huì)在烤制工業(yè)中發(fā)揮重要作用［6］。

Bowman(1945年)首次報(bào)道從白蕓豆中獲得α－AI［7］，與其他種類相比具有高效價(jià)，因其含有特殊類型的抑制劑 (耐熱和不耐熱［8］)而倍受關(guān)注。

現(xiàn)有的測(cè)定α－淀粉酶抑制劑活性的方法是將淀粉降解產(chǎn)物在特定條件下比色，測(cè)定其含有量，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。本實(shí)驗(yàn)在現(xiàn)有分析方法的基礎(chǔ)上做出有效的改進(jìn)，對(duì)DNS(3，5－二硝基水楊酸)比色法［9］測(cè)定白蕓豆中分離純化的α－淀粉酶抑制劑活性的操作條件進(jìn)行系列試驗(yàn)確定。

1 材料

1.1 儀器 日本島津UV－1700紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì);上海光地恒溫水浴鍋;上海實(shí)驗(yàn)儀器101A－3E烘箱;上海精密科學(xué)儀器BP211D電子天平。

1.2 藥品與試劑 DNS試劑［10］:取3，5－二硝基水楊酸精確稱取6.5 g溶解于400 mL蒸餾水中，在加入325 mL 2 mol/L的氫氧化鈉、15 mL丙三醇，充分溶解后定容至1 000 mL，于棕色試劑瓶保存，冰箱中放置一周后使用。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 (3 mg/mL):取經(jīng)105℃烘至恒定質(zhì)量的分析純葡萄糖精確稱取300 mg，用水溶解并定容至100 mL，保存于4℃冰箱中，備用。2%可溶性淀粉溶液:精確稱取可溶性淀粉2 g，用少量蒸餾水調(diào)勻，傾入已沸蒸餾水，在加熱煮沸至透明，冷卻后定容至100 mL。其他試劑有北京奧特星α－淀粉酶 (BR)。供試品α－AI，按以下方法從白蕓豆中獲得［11］:粉碎白蕓豆，經(jīng)過(guò)水浸提、硫酸銨鹽析、透析、DEAE－纖維素柱層析、冷凍干燥，得到產(chǎn)品 (白色粉未狀)［12］。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定原理 α－AI能特異性地抑制α－淀粉酶，減少α－淀粉酶對(duì)淀粉的水解，使其淀粉降解產(chǎn)物還原糖減少，還原糖可與3，5－二硝基水楊酸共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，顯紅棕色，在一定波長(zhǎng)下有最大吸收峰，且在此波長(zhǎng)下還原糖含有量與吸光值呈線性關(guān)系。對(duì)添加抑制劑前后生成還原糖的量進(jìn)行定量測(cè)定，可從前后變化測(cè)得α－AI的活性。

2.2 測(cè)定條件的選擇

2.2.1 吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 分別取0.5 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水，再加1 mL DNS試劑，沸水浴加熱5 min，流水冷卻，稀釋適當(dāng)倍數(shù)。分別在波長(zhǎng)300～500 nm和400～600 nm范圍內(nèi)，對(duì)DNS試劑本身 (蒸餾水調(diào)零)，未加α－AI的DNS顯色反應(yīng)液以及DNS顯色反應(yīng)液 (空白調(diào)零)的吸收光譜進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖 1。比較可知，DNS試劑(λmax=370 nm)在顯色反應(yīng)測(cè)定波長(zhǎng)處 (λmax=470 nm)無(wú)明顯吸收，可排除本底干擾，故選λmax=470 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum

2.2.2 DNS試劑用量的選擇 在系列已加入1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的試管中，分別加入DNS顯色劑0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，在沸水浴中加熱5 min，迅速流水冷卻，適當(dāng)稀釋。在相同條件下，不加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白，在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定不同DNS顯色劑用量下的吸收值。

從圖2可以看出，隨DNS顯色劑用量的增加，反應(yīng)液吸收值顯著增大，但在2 mL以后，吸收值增加緩慢，且趨于平緩。故選2 mL作為DNS顯色劑的用量。

圖2 DNS顯色劑用量對(duì)吸收值的影響Fig.2 Impact of DNS reagent dosage on the absorption value

2.2.3 顯色反應(yīng)時(shí)間的選擇 在系列加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL的試管中，分別加入DNS顯色劑2 mL，在沸水浴中分別加熱反應(yīng)1、3、5、7、9、11 min后取出，迅速流水冷卻，適當(dāng)稀釋。在相同條件下，以不加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白，在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定不同加熱反應(yīng)時(shí)間下的吸收值。從圖3可以看出，顯色反應(yīng)吸收值隨時(shí)間的增加而增大，5 min后吸收值變化趨于平穩(wěn)。故選5 min作為顯色反應(yīng)時(shí)間。

圖3 顯色反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸收值的影響Fig.3 Impact of reaction time on the absorption value

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6只試管依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入2 mL DNS顯色劑后充分混勻，在沸水浴中反應(yīng)5 min，迅速流水冷卻，適當(dāng)稀釋。以管1做為空白對(duì)照在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)各管的吸收值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:Y=0.817 4X+0.001 6，R2=0.999 6。表明在0.6～3 mg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖濃度和相應(yīng)的吸收值具有良好的線性關(guān)系。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取質(zhì)量濃度1.2 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入DNS顯色劑2 mL，于沸水浴中反應(yīng)5 min，迅速流水冷卻，分別放置30、60、90、120 min后在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)各管的吸收值，RSD=0.37%。圖4表明該測(cè)定方法下120 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 精密度測(cè)定 按1.2項(xiàng)中所述方法制備后，精密吸取樣品溶液500 μL，依照2.4項(xiàng)的DNS比色法，連續(xù)6次重復(fù)測(cè)定，結(jié)果表明該方法測(cè)定α－AI精密度良好，RSD=1.01%(n=6)。

圖4 放置時(shí)間對(duì)吸收值的影響Fig.4 Impact of standing time on the absorption value

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次樣品，精密稱取6份按照DNS比色法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明該測(cè)定方法重復(fù)性良好，RSD=0.94%(n=6)。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知量的樣品溶液500 μL，共9份。分別準(zhǔn)確加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.4項(xiàng)的DNS比色法測(cè)定，測(cè)得低、中、高3種加入量的回收率 (n=3)分別為100.3%、99.79%、99.84%;RSD分別為0.86%、0.68%、0.81%，平均回收率為99.95%(n=9)。

2.8 樣品測(cè)定

2.8.1 樣品管 精確吸取0.5 mL從白蕓豆中提取的α－AI和0.5 mLα－淀粉酶溶液，充分混勻，在37℃水浴中反應(yīng)15 min，然后加入1 mL 2%可溶性淀粉溶液，在37℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min。再加入2 mL DNS顯色劑，在沸水浴中反應(yīng)5 min，之后立即用流動(dòng)自來(lái)水冷卻 (終止反應(yīng))，用蒸餾水稀釋并定容至25 mL，再精確吸取1 mL用蒸餾水稀釋定容至25 mL，在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸收度，記為OD。

2.8.2 對(duì)照管 用蒸餾水代替α－AI，其他同上，記為 OD′。

2.8.3 空白管 用蒸餾水代替α－AI和α－淀粉酶溶液，其他同上。

α－淀粉酶抑制劑抑制率的計(jì)算公式為

按照上述測(cè)定方法，對(duì)樣品進(jìn)行α－AI活性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定(n=3)Tab.1 Sample determination(n=3)

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)顯色反應(yīng)的測(cè)定波長(zhǎng)、DNS顯色劑的用量以及顯色反應(yīng)的時(shí)間等一系列試驗(yàn)條件的研究，對(duì)白蕓豆中分離純化的α－淀粉酶抑制劑的DNS比色法測(cè)定，確定的最佳條件為:在470 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，α－AI與等量α－淀粉酶溶液在37℃反應(yīng)15 min，加入2%可溶性淀粉溶液在準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，再加入2 mL DNS顯色劑沸水浴中顯色5 min，迅速流水冷卻。此方法精密度 RSD為1.01%，平均回收率為99.95%(n=9)。該方法具有簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性好等特點(diǎn)，是對(duì)已有方法的完善和改進(jìn)，試圖探尋測(cè)定α－淀粉酶抑制劑活性的最佳方法和條件，適用于α－淀粉酶抑制劑活性的常規(guī)測(cè)定。該方法可作為篩選抗糖尿病藥物的有效方法。

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Activity determination of Phaseolus vulgaris α-amylase inhibitor by DNS colorimetry

ZHAO Rong1， LI Duo－wei2*， REN Tao2， LIN Fang2， LIN Dao－fa2

(1.Shaanxi Provincial Institute of Environmental Science，Xi'an 710069，China;2.Life Science College，Northwest University，Xi'an 710069，China)

Phaseolus vulgaris;DNS colorimetry;α－amylase inhibitor activity

R284. 1;Q55

A

1001－1528(2013)03－0573－04

10.3969/j.issn.1001－1528.2013.03.034

2012－04－17

趙 蓉 (1984—)，女，碩士生，主要從事環(huán)境科學(xué)研究。Tel:13572059463，E－mail:zrjbw@hotmail.com

*通信作者:李多偉 (1959—)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然動(dòng)植物資源提取、分離與植物細(xì)胞工程研究。Tel:13227796618，E－mail:duoweili@163.com