季 德，毛春芹，李金慈，陸兔林*，謝 輝，姜國非，肖永慶

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京 210023;2.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700)

莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis Val.、廣西莪術(shù)Curcuma.kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang和溫郁金 Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，具有行氣破血、消積止痛之功效［1］?，F(xiàn)代藥理學研究表明，莪術(shù)具有較好的抗腫瘤、抗血栓、抗炎、抗病毒、抗早孕、抗菌、保肝、抗銀屑病、抗纖維組織增生等多種藥理作用［2］。莪術(shù)藥材中主要含有揮發(fā)油類和姜黃素類兩大活性成分，其中莪術(shù)油(Zedoary turmeric oil，ZTO)臨床應用較廣泛，在抗腫瘤、抗血栓方面成效顯著［3］。目前國內(nèi)外對莪術(shù)揮發(fā)性成分的體內(nèi)藥動學研究主要集中于吉馬酮［4-5］、β-欖香烯［6］和莪術(shù)醇［7］，且以氣相色譜法和毛細管氣相色譜法研究為主。前期研究表明，莪術(shù)二酮和吉馬酮是莪術(shù)油中含量較高的主要有效成分，文獻報道其具有良好的抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓和鎮(zhèn)痛抗炎的作用［8-9］，常作為莪術(shù)藥材及莪術(shù)油質(zhì)量控制的指標性成分。但目前未見有同時測定大鼠血漿中莪術(shù)二酮和吉馬酮含量的方法并進行藥動學研究的報道，因此本研究選擇莪術(shù)二酮和吉馬酮為對象，建立了HPLC同時測定大鼠血漿中莪術(shù)二酮、吉馬酮的方法，并通過單次灌胃給予莪術(shù)揮發(fā)油乳劑后，研究了莪術(shù)二酮、吉馬酮在清醒大鼠體內(nèi)的藥動學特征，為莪術(shù)的臨床安全應用及進一步闡明其作用機制提供現(xiàn)代科學依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑 溫莪術(shù)生飲片(安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司供原藥自制;藥材產(chǎn)地為浙江;批號cw100409)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥用植物教研室巢建國教授鑒定;莪術(shù)二酮對照品(上海滬云醫(yī)藥開發(fā)有限公司，批號13657-68-6)，吉馬酮對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111665-200902)，乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)包括:四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器;色譜柱為依利特 Hypersil ODS2柱(4.6 mm×250 mm，5μm)(大連依利特分析儀器有限公司);預柱:依利特佳杰 C18柱(大連依利特分析儀器有限公司);XW—80A微型渦旋混合儀(上海精科實業(yè)有限公司)、TGL-16C高速離心機(上海安亭科學儀器廠);KQ—500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BS110電子分析天平(MettlerToledo，Switzerland);Milli-Q Gradient A10超純水器(Millipore Inc.USA)。

1.3 動物 清潔級SD大鼠，10只，雌雄各半，體質(zhì)量(250±20)g(上海斯萊克實驗動物有限公司提供，合格證號:SCXK(滬)2007-0005)。實驗前于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心適應性飼養(yǎng)一周，以適應本實驗室環(huán)境，實驗室溫度維持20～25℃，相對濕度70%左右，實驗前24 h禁食，自由飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 莪術(shù)揮發(fā)油給藥樣品的制備 取溫莪術(shù)生飲片，粉碎過3號篩，照2010版《中國藥典》附錄X D揮發(fā)油測定法甲法水蒸氣蒸餾法(SD法)提取莪術(shù)飲片中揮發(fā)油(其中莪術(shù)二酮、吉馬酮含量分別為8.6248%和6.0793%)，取7.5 g預先經(jīng)無水Na2SO4脫水的莪術(shù)揮發(fā)油，置于50 mL量瓶中，加入2.5 g吐溫－80作乳化劑，加滅菌水至刻度，混合均勻，超聲10 min，制成均一穩(wěn)定的白色乳狀液(莪術(shù)油質(zhì)量濃度為0.15 g/mL)，用前搖勻即得。

2.2 對照品溶液的配制 精密稱取莪術(shù)二酮、吉馬酮對照品適量，置量瓶中，加甲醇溶解定容，搖勻，經(jīng)稀釋后制得莪術(shù)二酮質(zhì)量濃度為137.28μg/mL，吉馬酮質(zhì)量濃度為25.24μg/mL的混合對照品貯備溶液，4℃冷藏備用。

2.3 血漿樣品的采集與處理 清潔級SD大鼠6只，雌雄各半，體質(zhì)量(250±20)g，實驗前24 h禁食不禁水，各眼眶取空白血0.5 mL，灌胃給予制備好的莪術(shù)油樣品2 mL，分別于0.5、1.0、2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 5.0、 6.0、 8.0、12.0、18.0、24.0 h共13個時間點處各自眼眶取血0.3 mL至預先加入適量枸櫞酸鈉抗凝劑的Eppendorf離心管中，5000 r/min離心10 min。吸取上層血漿50μL，精密加入乙腈100μL，渦旋混合2 min，14000 r/min離心 10 min，吸取上清液100μL置于進樣瓶中，HPLC 自動進樣 40μL測定。

2.4 色譜條件 以Elite Hypersil ODS2色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);乙腈(A) － 水(B)為流動相，進行梯度洗脫，0～20 min，50% ～80%(A);下一個梯度前用100%(A)沖洗色譜柱10 min，繼續(xù)用50%(A)平衡10 min;進樣量40μL;色譜柱柱溫30℃;流動相體積流量1.0 mL/min;VWD檢測器，檢測波長為214 nm。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法 采用DAS 2.0軟件進行房室模型擬合并計算藥物動力學參數(shù)，采用SPSS 15.0進行統(tǒng)計學分析。

2.6 分析方法的確證

2.6.1 方法的專屬性 在上述色譜條件下，莪術(shù)二酮、吉馬酮的保留時間分別為11.3 min和17.9 min，在莪術(shù)二酮和吉馬酮出峰處，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不出峰，不干擾莪術(shù)二酮和吉馬酮的測定結(jié)果，給藥后的血漿中其他內(nèi)源性雜質(zhì)色譜峰與莪術(shù)二酮和吉馬酮對照品色譜峰分離度均在1.5以上。見圖1。

圖1 血漿樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of rat

2.6.2 標準曲線的繪制 取大鼠空白血漿，分別加入從對照品貯備液稀釋的莪術(shù)二酮和吉馬酮對照品溶液，混和均勻，分別制成莪術(shù)二酮目標質(zhì)量濃度 為 1.073、 2.145、 4.290、 8.580、 17.16、34.32、68.64μg/mL，吉馬酮目標質(zhì)量濃度為0.1972、 0.3944、 0.7888、 1.578、 3.155、6.310、12.62μg/mL的血漿樣品，按2.3項下操作，取上清液40μL進樣，記錄色譜圖，以相應待測物峰面積值(Y)對相應的對照品質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸處理，得莪術(shù)二酮的標準曲線回歸方程為Y=16.245x+64.196，R=0.9943，檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.073～68.64μg/mL;吉馬酮的標準曲線回歸方程為Y=30.265x+41.504，R=0.9958，檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.1972～12.62μg/mL。

2.6.3 精密度實驗 取大鼠空白血漿50μL，按照“標準曲線的繪制”項下方法分別配制莪術(shù)二酮質(zhì)量濃度為4.29、17.16、68.64μg/mL和吉馬酮質(zhì)量濃度為0.7888、3.155、12.62μg/mL的血漿樣品各6份，按2.3項下操作，取上清液40μL進樣，按2.4項下色譜條件進行分析，于日內(nèi)和連續(xù)6 d內(nèi)測定各樣品，計算日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1。結(jié)果表明此方法符合生物樣品的測定要求，可以用于血漿中莪術(shù)二酮和吉馬酮的測定。

表1 大鼠血漿樣品中莪術(shù)二酮、吉馬酮測定方法的精密度(n=6)Tab.1 Precision of curdione and germacrone of the assay in rat plasma(n=6)

2.6.4 穩(wěn)定性考察 取大鼠空白血漿適量，按照2.3項下操作，分別配制莪術(shù)二酮質(zhì)量濃度為4.29、17.16、68.64μg/mL和吉馬酮質(zhì)量濃度為0.7888、3.155、12.62μg/mL血漿樣品各 6份，混和均勻，－20℃冷凍保存，分別進行長期穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性試驗。將以上血漿樣品分別于0、1、2、3、4 d取出，室溫融化后按2.4項下操作，取上清液進樣40μL，考察莪術(shù)二酮和吉馬酮在大鼠血漿中含量測定的長期穩(wěn)定性。將以上血漿樣品反復凍融5次，考察凍融穩(wěn)定性。將剛配制好的血漿樣品溶液室溫25℃放置，于0、4、8、12、16 h，按 2.4項下操作，取上清液40μL進樣，考察短期穩(wěn)定性。結(jié)果見表2。

表2 大鼠血漿樣品中莪術(shù)二酮、吉馬酮的穩(wěn)定性結(jié)果(n=6)Tab.2 Stability of curdione and germacrone in rat plasma(n=6)

結(jié)果可見莪術(shù)二酮和吉馬酮血漿加藥樣品的室溫穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性的測定結(jié)果變化均在允許范圍內(nèi)(RSD＜15%)，保證了樣品測定結(jié)果的可靠性。

2.6.5 提取回收率和方法回收率 取大鼠空白血漿100μL，加入不同質(zhì)量濃度混合對照品，配置低、中、高3個質(zhì)量濃度(莪術(shù)二酮質(zhì)量濃度為4.29、17.16、68.64μg/mL和吉馬酮質(zhì)量濃度為0.7888、3.155、12.62μg/mL)的血漿樣品各 6份，按2.3項下操作，取上清液40μL進樣，按上述色譜條件分離，記錄莪術(shù)二酮和吉馬酮的峰面積A。另配制低、中、高質(zhì)量濃度的莪術(shù)二酮和吉馬酮對照品溶液各1份，使莪術(shù)二酮的質(zhì)量濃度分別為4.29、17.16、68.64μg/mL，吉馬酮的質(zhì)量濃度分別為 0.7888、3.155、12.62μg/mL，各取40μL進樣，記錄莪術(shù)二酮和吉馬酮的峰面積B。根據(jù)A/B×3×100%，計算提取回收率。將血漿樣品測得的莪術(shù)二酮、吉馬酮的峰面積A代入標準曲線回歸方程，分別計算其質(zhì)量濃度，以測得值與加入量的比值計算方法回收率。結(jié)果見表3。

表3 大鼠血漿樣品中莪術(shù)二酮和吉馬酮的提取回收率和方法回收率結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of extraction recovery and method recovery of curdione and germacrone in rat plasma(n=6)

2.7 藥動學研究 大鼠灌胃給予2 mL莪術(shù)油乳狀液后(含0.3 g莪術(shù)揮發(fā)油)血漿中莪術(shù)二酮和吉馬酮的血藥濃度-時間曲線見圖2。根據(jù)AIC值最小的原則，判定大鼠灌胃給予莪術(shù)油后，血漿中莪術(shù)二酮和吉馬酮的藥物濃度-時間曲線均符合權(quán)重因子為1/C2的二室模型，實驗中經(jīng)擬合計算得出的主要藥動學參數(shù)見表4。

圖2 大鼠血漿中莪術(shù)二酮、吉馬酮的血藥濃度-時間曲線Fig.2 Concentration-time curves of curdione and germacrone in rat plasma

3 討論與小結(jié)

3.1 給藥劑型與劑量的選擇 前期實驗中發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)油的黏度較大，灌胃給藥時無法準確定量給藥，且據(jù)文獻報道［5］莪術(shù)油直接灌胃給藥后吸收非常緩慢，故參照文獻方法加入吐溫－80作乳化劑制備莪術(shù)油乳劑，質(zhì)量濃度為0.15 g/mL。文獻中［5］大鼠給藥劑量為0.5 g莪術(shù)油，本實驗發(fā)現(xiàn)每只大鼠(標準體質(zhì)量0.25 kg)給藥量為0.3 g莪術(shù)油時，便可在血漿中檢測出莪術(shù)二酮和吉馬酮。

表4 大鼠灌胃給予莪術(shù)油乳劑后莪術(shù)二酮、吉馬酮的主要藥動學參數(shù)(，n=6)Tab.4 Main pharmacokinetic parameters of curdione and germacrone after oral administration of ZTOE in rats(，n=6)

表4 大鼠灌胃給予莪術(shù)油乳劑后莪術(shù)二酮、吉馬酮的主要藥動學參數(shù)(，n=6)Tab.4 Main pharmacokinetic parameters of curdione and germacrone after oral administration of ZTOE in rats(，n=6)

藥動學參數(shù) 單位 莪術(shù)二酮 吉馬酮Tmax h 3.000 ± 0.000 3.500 ± 0.000 Cmax mg/L 34.969 ± 0.700 6.361 ± 0.300 T1/2α h 1.102 ± 0.030 1.479 ± 0.483 T1/2β h 8.417 ± 0.408 6.282 ± 1.994 V L/kg 1.295 ± 0.076 6.261 ± 1.128 CL L/h/kg 0.471 ± 0.027 1.974 ± 0.083 AUC(0-tn) mg/L*h 242.142 ± 8.146 43.472 ± 1.713 AUC(0-∞) mg/L*h 275.282 ± 16.222 46.266 ± 1.871 K10 0.365 ± 0.030 0.324 ± 0.061 K12 0.174 ± 0.020 0.092 ± 0.038 K21 0.174 ± 0.008 0.203 ± 0.063 ka 1/h 0.874 ± 0.048 0.749 ± 0.050

3.2 測定方法的確定 莪術(shù)揮發(fā)性成分的體內(nèi)藥動學研究方法較多，有氣相色譜法［10］，毛細管氣相色譜法［11］，HPLC［5］，HPLC-MS［7］等。本研究采用HPLC法對大鼠血漿中莪術(shù)二酮、吉馬酮的含有量進行測定。本實驗參照相關(guān)文獻［12］取214 nm為檢測波長，通過比較最終選擇流動相為乙腈(A)-水(B)進行梯度洗脫，0～20 min為50% ～80%(A)。結(jié)果表明，所建立的HPLC法操作簡單、方法靈敏、結(jié)果準確可靠，適用于莪術(shù)二酮和吉馬酮在大鼠體內(nèi)血藥濃度的測定及藥代動力學研究。

3.3 藥動學結(jié)果分析 本實驗表明，對正常大鼠一次性灌胃給予0.3 g莪術(shù)揮發(fā)油后，莪術(shù)二酮、吉馬酮在體內(nèi)均呈二室模型，其達峰時間Tmax分別為3 h和3.5 h，表明大鼠灌胃莪術(shù)油后莪術(shù)二酮和吉馬酮吸收較慢。此外，莪術(shù)二酮和吉馬酮的達峰濃度Cmax分別為(34.969±0.70)μg/mL和(6.577±0.52)μg/mL。兩種成分的消除半衰期T1/2β莪術(shù)二酮(8.417±0.408)h，吉馬酮為(6.282±1.994)h，說明莪術(shù)二酮的消除速度慢于吉馬酮。由于灌胃給藥可能會存在肝腸循環(huán)從而干擾消除相動力學參數(shù)的計算，因此需要進一步的肝腸藥代動力學實驗證明。

綜上所述，本實驗建立了大鼠血漿中莪術(shù)二酮、吉馬酮的HPLC測定方法，該法操作簡單、專屬準確、靈敏可靠。研究結(jié)果為莪術(shù)的臨床給藥方案設計和優(yōu)化提供了有價值的實驗數(shù)據(jù)，為進一步研究莪術(shù)活性成分的體內(nèi)藥動學行為提供了重要的依據(jù)。

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