陳洪艷，李忻紅

（1.遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，沈陽110032）

銀屑病，中醫(yī)稱之為“白疕”，屬于多基因遺傳的疾病，可由多種激發(fā)因素誘發(fā)。其病生理機制主要為表皮增生分化的異常和免疫系統(tǒng)的激活。白疕合劑為我科多年臨床經(jīng)驗總結(jié)制成的院內(nèi)制劑，臨床治療尋常性銀屑病患者取得滿意療效，進展期效果尤為顯著[1]。本研究以銀屑病小鼠模型為研究對象，觀察中藥白疕合劑對小鼠T淋巴細胞凋亡及角質(zhì)形成細胞抑制的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 白疕合劑（院內(nèi)中藥制劑，制劑號：Z05010105，主要組成：生地、白茅根、丹參、金銀花、板藍根、白花蛇舌草等九味藥）；消銀顆粒（陜西康惠制藥有限公司，制劑號：Z20000019）；苯甲酸雌二醇注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司）；兔抗小鼠增殖細胞核抗原（PCNA）一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-0754R）；免疫組化SP試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)科技有限公司，批號：SP-0024）等。

1.2 動物 昆明種雌性小鼠，鼠齡6～8周，每只體質(zhì)量18～22g，共72只（中國醫(yī)科大學實驗動物中心）。

1.3 儀器 超薄切片機：LKBV型，瑞典LKB公司、透射電子顯微鏡：JEM-100CXII型，日本電子公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，HH·B11·500型，上海躍進醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；微量移液器，美國熱電公司生產(chǎn)；脫水機，LEICA 300型，德國徠卡公司生產(chǎn)；石蠟包埋機，EG1150型，德國徠卡公司生產(chǎn)；切片機，LEICARM2235型，德國徠卡公司生產(chǎn)；數(shù)碼顯微鏡，OLYMPUS BX41型。日本OLYMPUS公司生產(chǎn)；生物顯微鏡，CHA型，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)等。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 雌性昆明小鼠72只，按隨機數(shù)字表分為6組，每組12只：空白對照組、陰性對照組、白疕合劑高、中、低劑量組、消銀顆粒組。

1.4.2 動物給藥劑量 用藥量按成人100 g/70 kg每日計算，小鼠給藥劑量按照人與小鼠體表面積比例進行換算，得出小鼠給藥劑量為0.115 g/（10 g·d）。因此設(shè)定的白疕合劑高、中、低劑量組灌胃濃度分別為2.3、1.15、0.575g/mL，給藥量為0.2mL/（10g·d）。消銀顆粒組灌胃量0.2g/（10 g·d），模型組小鼠每日以等量生理鹽水灌胃，空白對照組正常喂養(yǎng)，連續(xù)給藥28 d。

1.4.3 銀屑病小鼠模型制備 將除空白對照組以外的60只小鼠，腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液0.2 mg/10 g，1次/d，連續(xù) 3 d，使所有小鼠處于雌激素期。各組動物分別稱質(zhì)量，按體質(zhì)量灌飼器灌胃給藥，1次/d，連用4周。根據(jù)體質(zhì)量變化，隨時調(diào)整灌藥劑量。

1.4.4 實驗方法與指標檢測

1.4.4.1 透射電鏡下觀察脾臟中淋巴細胞凋亡 頸椎脫位處死小鼠，無菌取脾，常規(guī)制備脾細胞懸液，1500 r/min，離心10 min，去上清。加入2 mL 2.5%戊二醛固定，然后經(jīng)過常規(guī)包埋、切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并攝片。

1.4.4.2 SP免疫組化法觀察小鼠人角質(zhì)形成細胞（KC）細胞增殖核抗原PCNA的抑制作用 末次給藥1 h后，各組隨機抽取8只小鼠用于免疫組化法檢測PCNA蛋白表達水平，取各組小鼠陰道上皮組織，用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片、脫蠟、抗原修復(fù)，然后采用免疫組化SP法進行PCNA蛋白表達水平檢測。切片染色后，光鏡下選擇染色良好區(qū)域，應(yīng)用Leica Q550CW圖像采集和分析系統(tǒng)，測定單位面積陽性細胞表達的灰度平均值作為其表達情況，由于該分析系統(tǒng)將白色灰度值設(shè)定為255，將黑色灰度值設(shè)定為0，故灰度值越高，表達水平越低。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析（Oneway ANOVA），樣本均數(shù)間的比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 白疕合劑及消銀顆粒對小鼠T淋巴細胞凋亡的誘導(dǎo)作用 與空白對照組相比，白疕合劑高、中、低劑量組均能出現(xiàn)細胞凋亡，電鏡下觀察正常組能見淋巴細胞核大圓型，異染色質(zhì)分布在核的周邊，核仁明顯，中藥高劑量、中劑量、低劑量組較空白組比較出現(xiàn)凋亡小體，以高劑量最為明顯，消銀顆?？梢娚倭康蛲鲂◇w。結(jié)果見圖1。

圖1 白疕合劑及消銀顆粒對小鼠T淋巴細胞凋亡的影響（醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色×10000倍）

2.2 白疕合劑對小鼠陰道組織中PCNA表達的影響 模型組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明造模成功，見表 1。與模型組比較，白疕合劑高、中、低劑量組均能明顯誘導(dǎo)T淋巴細胞增凋亡，抑制KC細胞增殖核抗原PCNA。SABC免疫組化法觀察對照組小鼠PCNA表達陽性率和著色深度，著色淺，層次清楚；模型組小鼠著色深；中藥高劑量、中劑量、低劑量組較模型組均著色深，以高劑量組最為明顯；消銀顆粒組著色較深，層次較清楚。PCNA蛋白表達檢測結(jié)果見圖2。

表1 白疕合劑對小鼠陰道組織中PCNA的表達 (±s，n=8)

表1 白疕合劑對小鼠陰道組織中PCNA的表達 (±s，n=8)

注：與空白對照組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.01；與消銀顆粒組比較，#P<0.01，##P<0.05。

組別 藥量（g/kg） 平均灰度值空白對照組 - 179.61±11.62*#模型組 - 97.55±4.36△#白疕高劑量組 11.5 141.10±3.42△*#白疕中劑量組 23.0 139.34±1.81△*##白疕低劑量組 46.0 116.69±2.25△*消銀顆粒組 20.0 118.52±1.66△*

圖2 白疕合劑及消銀顆粒對小鼠陰道組織中PCNA蛋白表達（D A B顯色×400倍）

3 討論

銀屑病是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性紅斑鱗屑性皮膚病，其病理生理特點包括KC過度增殖和分化不全兩方面。雌激素周期的小鼠陰道上皮增生活躍，有絲分裂增多，細胞轉(zhuǎn)化加快，模擬了銀屑病表皮增生過快的特點[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)其臨床表現(xiàn)與KC細胞及T淋巴細胞相關(guān)。

銀屑病的發(fā)病機制還不十分清楚，現(xiàn)認為T細胞在銀屑病發(fā)病中的重要作用，銀屑病發(fā)病原因在于T淋巴細胞的異常，T細胞的活化是銀屑病發(fā)病機制中的關(guān)鍵一步，其在進入皮損前已經(jīng)活化，活化T細胞釋放炎癥性細胞因子,誘導(dǎo)角化細胞增殖，所以專家認為T細胞是銀屑病表皮過度增殖的介質(zhì)[3-4]。本實驗結(jié)果顯示，銀屑病小鼠T淋巴細胞均有不同程度下降，與陰性對照組比較，白疕合劑各劑量組均能誘導(dǎo)小鼠T淋巴細胞的凋亡，各組差異不明顯。

PCNA與細胞增殖的關(guān)系已經(jīng)得到公認,但對銀屑病與PCNA的關(guān)系研究甚少[5]。雌激素化的小鼠陰道上皮細胞處于增殖狀態(tài),用PCNA標記可從分子水平反映其增殖程度的變化,作為藥效學研究指標更直觀可靠。實驗證明雌激素化的小鼠陰道上皮PCNA活躍表達,經(jīng)白疕合劑各劑量組治療后,PCNA表達明顯受到抑制,白疕合劑對小鼠陰道上皮細胞PCNA表達影響的趨勢與白疕合劑對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂影響的趨勢有一致性，即有絲分裂指數(shù)以及PCNA陽性細胞數(shù)與藥物濃度呈負相關(guān),說明中藥白疕合劑對小鼠陰道上皮細胞的增殖抑制作用療效確切[6]。

以上研究提示，白疕合劑對T形成細胞凋亡的誘導(dǎo)作用及對小鼠陰道上皮PCNA表達的抑制作用可能是白疕合劑治療銀屑病的作用機制之一。

［1］李忻紅，盧益萍.白疕合劑治療尋常性銀屑病臨床觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學雜志，2011，10（1）：40－41.

［2］盧傳堅，吳曉霞，劉鳳年.銀屑靈對PCNA表達和角質(zhì)形成細胞凋亡的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2006，17（5）：330－331.

［3］趙艷霞.T淋巴細胞與銀屑病發(fā)病機制的關(guān)系[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學雜志，2010，9（6）：398.

［4］艾克拜爾·安扎爾，熱孜萬·烏買爾.銀屑病的T淋巴細胞介導(dǎo)免疫機制進展[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010，1（2）：85.

［5］馮捷，蘇寶山，鄭玉萍，等.銀屑病表皮中增殖細胞抗原與轉(zhuǎn)化生長因子的表達水平[J].西安醫(yī)科大學學報，1996，17（2）：218.

［6］劉擁軍.銀消丸對小鼠陰道上皮增殖細胞核抗原（PCNA）表達的影響[J].中國中醫(yī)藥科技，2007，14（6）：471.