張峻嶺 ，柳君如 ，徐士福 ，程琳 ，ZHOU Youwen

（1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津300120；2.解放軍第四零四醫(yī)院，威海264200；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，杭州310003；4.河北省石家莊市婦幼保健院，石家莊050000；5.不列顛哥倫比亞大學(xué)，溫哥華V5Z4E8）

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為白癜風(fēng)是一種自身免疫相關(guān)性皮膚病，近年來發(fā)現(xiàn)基因的差異表達(dá)在免疫性皮膚病中起著非常重要的作用，國外學(xué)者Youwen Zhou教授首次發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)皮損區(qū)CLEC2B（C-type lectin domain family 2,member B）mRNA表達(dá)高于非皮損區(qū)，并經(jīng)RT-PCR方法確證。我們在以往的研究中應(yīng)用實時熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者皮損區(qū)CLEC2B基因較正常人表達(dá)增加,并發(fā)現(xiàn)CLEC2B基因過表達(dá)的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液對黑素細(xì)胞的增殖和黑素合成有一定的抑制作用[1]。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步利用RNA干擾技術(shù)，使CLEC2B基因沉默，觀察CLEC2B基因沉默后的淋巴細(xì)胞上清液對黑素細(xì)胞增殖活性的影響，從而進(jìn)一步探索CLEC2B基因在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 DMRIE-C脂質(zhì)體及OPTI MEM購于美國Invitrogen公司，CLEC2B引物序列由不列顛哥倫比亞大學(xué)Youwen Zhou教授惠贈，CLEC2BsiRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成，RPMI1640液態(tài)培養(yǎng)基購于美國Gibco公司,DMEM高糖液態(tài)培養(yǎng)基、TBD胎牛血清購于天津灝洋生物科技有限公司，TRIzol、TRANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix（SYBR Green I）均購于天根生化科技有限公司，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢驗試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司，DMSO購于美國Sigma公司，人Jurkat淋巴瘤細(xì)胞株來自中國科學(xué)院血液病研究所，小鼠B16黑素瘤細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)條件均為37℃，5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)，Jurkat淋巴瘤細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基，以密度為2×105/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶；小鼠B16黑素瘤細(xì)胞以2～3×105/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，高糖DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞以對數(shù)生長期、密度近1×106/mL（融合度近80%）時進(jìn)行實驗。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 DMRIE-C脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染3條CLEC2BsiRNA入Jurkat淋巴瘤細(xì)胞，采用反向轉(zhuǎn)染法[2]，轉(zhuǎn)染體系為600μL，siRNA終濃度約80 nmol/L，siRNA:DMRIE-C 實際配比=3 μL∶2 μL。實驗共設(shè)定CLEC2B沉默組、非沉默對照組（siRNA對照組，轉(zhuǎn)染scrambledsiRNA，）及空白對照組（不作任何處理），轉(zhuǎn)染具體步驟試劑盒說明操作。

1.2.3 CLEC2B基因沉默效率檢測 轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行RNA提取、cDNA合成及實時熒光定量PCR方法檢測CLEC2B基因沉默效率。具體步驟按照試劑盒說明操作。CLEC2B上游引物5'-CCCCTATGATTGGATTGGTT-3’，下游引物 5'-GGCATGTTGAGTGGAACAGT-3，產(chǎn)物大小 79bp；βactin上游引物5'-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT-3'，下游引物5'-TGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3'，產(chǎn)物大小124 bp。應(yīng)用RG-3000熒光定量PCR儀（澳大利亞Corbett Research Sydney公司）進(jìn)行檢測以選取沉默效率最高的CLEC2BsiRNA進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4 CLEC2B基因沉默后淋巴細(xì)胞增殖率檢測及淋巴細(xì)胞上清液作用后黑素細(xì)胞增殖率檢測 ①Jurkat淋巴瘤細(xì)胞增殖率檢測，選擇轉(zhuǎn)染后48 h CLEC2B基因沉默率最高的轉(zhuǎn)染組，采用MTT比色法。實驗分組：空白對照組（未進(jìn)行轉(zhuǎn)染）、非沉默對照組（轉(zhuǎn)染scrambled siRNA，該siRNA無基因干擾效應(yīng)，是與目的基因序列無同源性的陰性對照siRNA序列,即siRNA對照組）、CLEC2B沉默組（轉(zhuǎn)染最佳CLEC2BsiRNA），每組設(shè)3個復(fù)孔。選擇基因沉默效率最高的CLEC2BsiRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，MTT法測細(xì)胞增殖率，具體步驟按說明書進(jìn)行。酶標(biāo)儀在570 nm波長處測各孔的光密度（A值）。②淋巴細(xì)胞上清液作用后黑素細(xì)胞增殖率檢測,實驗設(shè)CLEC2B沉默組（最佳沉默組上清液100 μL+10%血清 DMEM 培養(yǎng)基液 100 μL）、非沉默組（非沉默組上清液100 μL+10%血清DMEM培養(yǎng)基液 100 μL）、空白對照組（D-Hank’s液 100 μL+10%血清DMEM培養(yǎng)基液100 μL），每組設(shè)3個復(fù)孔，孵育48 h后MTT法檢測黑素細(xì)胞增殖情況，酶標(biāo)儀在550 nm波長檢測各孔的光密度（A值）。

1.2.5 結(jié)果分析 基因表達(dá)相對變化采用2△△Ct法處理數(shù)據(jù)[3]。統(tǒng)計分析時用△Ct代表基因的相對定量，Ct值代表目標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)?！鰿t=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，△△Ct=待測樣本△Ct-標(biāo)準(zhǔn)樣本△Ct。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料符合正態(tài)分布分別以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩樣本間均數(shù)的比較采用t檢驗；多個樣本均數(shù)間的多重比較用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計，采用單因素方差分析及SNK法多重比較，進(jìn)行多組間及兩兩組間比較及統(tǒng)計分析，兩樣本間比較采用t檢驗，顯著性檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CLEC2B基因沉默效率檢測 轉(zhuǎn)染CLEC2BsiRNA后，各轉(zhuǎn)染組淋巴細(xì)胞較非沉默對照組CLEC2BmRNA表達(dá)下降。3條siRNA序列對CLEC2B基因沉默效率不等，分別為C1組：23±3.3%，C2組：35±1.9%，C3組：14.8±2.5%。其中 C2組siRNA沉默效率最高，可達(dá)到35±1.9%（t=15.9，P<0.05）。上述結(jié)果顯示RNA干擾實現(xiàn)了對淋巴細(xì)胞CLEC2B基因mRNA的表達(dá)抑制。

2.2 CLEC2B基因沉默后對淋巴細(xì)胞增殖影響CLEC2B基因沉默后淋巴細(xì)胞增殖率檢測結(jié)果示：A值，CLEC2B 沉默組 0.36±0.04，非沉默組 0.35±0.03，空白對照組0.39±0.04，經(jīng)單因素方差分析SNK法檢驗無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（F=1.95，P>0.05），提示CLEC2B基因一定程度下沉默對淋巴細(xì)胞增殖率的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 CLEC2B基因沉默后淋巴細(xì)胞上清液對黑素細(xì)胞增殖率的影響 采用MTT法檢測淋巴細(xì)胞上清液對黑素細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果見表1。3組間A值差異經(jīng)單因素方差分析SNK法檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.67，P<0.05），進(jìn)一步進(jìn)行2組間比較發(fā)現(xiàn)，CLEC2B沉默組與非沉默組/空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示：空白對照組，未添加淋巴細(xì)胞上清液，黑素細(xì)胞生長狀態(tài)良好；非沉默組淋巴上清液對黑素細(xì)胞有較強(qiáng)抑制作用，其增殖率約為70%；CLEC2B基因沉默后淋巴細(xì)胞上清液雖仍然對黑素細(xì)胞有抑制作用，但其程度較未沉默組有所下降，黑素細(xì)胞增殖率約為87%。該結(jié)果提示，CLEC2B沉默后淋巴細(xì)胞上清液減輕了對黑素瘤細(xì)胞增殖的抑制，有利于黑素細(xì)胞存活。

表1 CLEC2B基因沉默后淋巴細(xì)胞上清液對黑素細(xì)胞增殖的影響(n=3)

3 討論

人類自然殺傷基因復(fù)合體（NKC）包括大量C型凝集素樣受體，其表達(dá)于多種免疫細(xì)胞，包括自然殺傷細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。在人體中，C型凝集素樣受體分為CLEC-2家族，主要包括CLEC2A，AICL（CLEC2B），CD69（CLEC2C），和 LLT1（CLEC2D）。CLEC2B為CLEC-2家族的一個分型，是一個分子質(zhì)量為33 kd的Ⅱ型跨膜糖蛋白，屬于C型凝集素受體家族“Dectin-1集群”成員之一，其編碼基因位于12號染色體12p13-p12 NK細(xì)胞基因復(fù)合體區(qū)。研究顯示該基因可在NK細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)[4-5]。并有研究報道AICL通過與NKp80結(jié)合，可對NK細(xì)胞及效應(yīng)記憶T細(xì)胞（CD8+T）產(chǎn)生一定的激活作用[6]。也有研究顯示在活化的淋巴細(xì)胞該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加，為淋巴細(xì)胞活化后早期轉(zhuǎn)錄表達(dá)的基因[7]。

已有研究表明，NK細(xì)胞與T細(xì)胞之間存在密切的免疫相關(guān)性，多種細(xì)胞因子參與彼此之間的調(diào)節(jié)，其共同終末效應(yīng)為作用于黑素細(xì)胞，影響其存活及黑素合成功能。筆者曾研究顯示CLEC2B過表達(dá)的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液抑制黑素細(xì)胞增殖，推測CLEC2B基因過表達(dá)可能參與白癜風(fēng)的發(fā)病[1]，本實驗顯示CLEC2B基因沉默后的淋巴細(xì)胞上清液作用于黑素細(xì)胞后，沉默組增殖率較未沉默組增加，推測該基因沉默后可能抑制了白癜風(fēng)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，改善黑素細(xì)胞微環(huán)境，從而減輕了對黑素細(xì)胞增殖的抑制作用，有利于黑素細(xì)胞的生存，本實驗結(jié)果進(jìn)一步支持CLEC2B基因參與白癜風(fēng)發(fā)病。其機(jī)制可能通過影響某些細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)，直接刺激T淋巴細(xì)胞活化和間接影響NK細(xì)胞的功能，最終導(dǎo)致黑素細(xì)胞減少而參與白癜風(fēng)發(fā)病。

［1］張峻嶺,徐士福,柳君如,等.CLEC2B基因過表達(dá)的Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)上清液對黑素瘤細(xì)胞B16的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2012,11（6）：348-350.

［2］楊萍,嚴(yán)金川,劉培晶.siRNA反向轉(zhuǎn)染法提高原代懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的應(yīng)用[J].江蘇大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2010,20（3）:267-269.

［3］Pfaffl MW.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucleic Acids Res,2001,29:e45.

［4］Holmskov U,Malhotra R,Sim RB,et al.Collectins:collagenous C-type lectins of the innate immune defense system[J].Immunol Today,1994,15:67-74.

［5］ Ljunggren HG.Cancer immunosurveillance:NKG2D breaks cover[J].Immunity,2008,28:492-494.

［6］Kuttruff S,Koch S,Kelp A,et al.NKp80 defines and stimulates a reactive subset of CD8 T cells[J].Blood,2009,113:358-369.

［7］ Eichler W,Ruschpler P,Wobus M,et al.Differentially induced expression of C-type lectins in activated lymphocytes[J].J Cell Biochem Suppl,2001,Suppl 36:201-208.