閆小寧 ，張建榮 ，李文彬 ，田慶 ，陳樂(lè)

（1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安710004；2.陜西省友誼醫(yī)院，西安710068)

硬皮病是一種病因不明的結(jié)締組織病，表現(xiàn)為不同程度地皮膚硬化和內(nèi)臟器官纖維化。溫陽(yáng)除痹湯是陜西省中醫(yī)院多年臨床實(shí)踐總結(jié)的治療硬皮病的經(jīng)驗(yàn)藥方，對(duì)“陽(yáng)虛血瘀證”硬皮病療效顯著。由于中藥成分復(fù)雜，其具體作用機(jī)制不明，本實(shí)驗(yàn)采用Yamamoto[1]硬皮病動(dòng)物模型造模方法，研究中藥復(fù)方溫陽(yáng)除痹湯對(duì)硬皮病小鼠模型皮損處細(xì)胞因子結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connect tissue growth factor,CTGF）蛋白和基因的影響，對(duì)其治療硬皮病的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為中醫(yī)治療硬皮病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠40只，6周齡，體質(zhì)量（20±5）g購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心。清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室室溫20～24℃普通飼料和水喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器 多克隆抗體兔抗鼠CTGF抗體（1∶50）為武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)（上海四星生物技術(shù)有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑（Promega公司）；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取10 mg脯氨酸，用少量80%乙醇溶解，蒸餾水定容至100 mL（100 mg/L）。再用蒸餾水稀釋成1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，20.0 mg/L 的系列溶液。羥脯氨酸含量測(cè)定試劑（南京建成生物制劑公司生產(chǎn)）。

1.3 主要藥品 博來(lái)霉素粉針（Bleomycin，BLM），15 mg/支，日本化藥株式會(huì)社產(chǎn)品，批號(hào)：450260；0.01 mol/L pH7.4 磷酸緩沖液（phosphate buffer，PBS）西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室配置。青霉胺：上海醫(yī)藥有限公司信誼制藥總廠（批號(hào)051102）用蒸餾水配制成2.273 g/L。溫陽(yáng)除痹湯（丹參、桃仁、紅花、黃芪、當(dāng)歸、仙靈脾、赤芍、莪術(shù)、穿山甲）組成，該方一劑共含生藥187 g，生藥購(gòu)自陜西省中醫(yī)醫(yī)院中藥房，用蒸餾水1000 mL浸泡30 min后在陶瓷煎鍋內(nèi)以中火煎40 min，倒出藥液，再加入500 mL蒸餾水將藥渣重煎20 min。合并頭煎、二煎藥液，以小火濃縮至120 mL，使藥液濃度為生藥1.5 g/mL，2000 r/min離心取上清液，置-4℃冰箱保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模 將40只BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后按照數(shù)字表法隨機(jī)分為2組，1組8只為對(duì)照組；一組32只為造模組。造模組小鼠均剃除背部中央?yún)^(qū)被毛，模型組以41/2注射針頭，皮下注射200 mg/L BLM溶液（博萊霉素磷酸緩沖液）0.1 mL，1次/d連續(xù)3周。動(dòng)物模型見(jiàn)圖1。

圖1 硬皮病小鼠模型照片

1.4.2 動(dòng)物給藥 造模3周后將造模組小鼠隨機(jī)分為4組：模型組、生理鹽水組、青霉胺組和中藥組，各組分別灌服對(duì)應(yīng)藥物，給藥劑量根據(jù)每千克體質(zhì)量占體表面積的相對(duì)比值與人所需劑量換算得出[2]，成人每天中藥所含生藥量原為3.1 g/kg體質(zhì)量，折算至小鼠為每天38.75 g/kg體質(zhì)量，成人每日青霉胺用量為1 g/kg體質(zhì)量，折算至小鼠為每日12.5 g/kg，用蒸餾水配制成2.273 g/L。各組根據(jù)個(gè)體質(zhì)量分別灌服藥物，連續(xù)給藥1個(gè)月。最后1次給藥24 h后處死全部小鼠，切下注射部位皮膚，一部分10%甲醛固定石蠟包埋，剩余部分置于液氮中儲(chǔ)藏備用。

1.4.3 真皮厚度測(cè)量 應(yīng)用醫(yī)學(xué)彩色病理圖像分析系統(tǒng)Motic Images Advanced 3.1測(cè)量真皮厚度，每張切片測(cè)6處，取均值，比較給藥后各組真皮厚度的變化。

1.4.4 羥脯氨酸（hydroxyproline,HYP）含量測(cè)定稱取小塊硬皮病小鼠皮膚組織各約30 mg剪碎加水解液水解，然后離心10 min；取上清0.6 mL，依次加入3種試劑后，混勻，60℃水浴15 min，3500 r/min，離心10 min；取上清在550 nm、0.5 cm光徑下測(cè)定各管的吸光度，之后按照說(shuō)明書(shū)公式計(jì)算皮膚組織羥脯氨酸含量。HYP計(jì)算公式：羥脯氨酸量=（測(cè)定管吸光度-空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（2 mg/L）÷蛋白含量（mg蛋白/mL）

1.4.5 蛋白印跡法檢測(cè) 提取皮膚組織蛋白勻漿，用紫外分光光度計(jì)（650 rim）測(cè)定蛋白濃度。組織勻漿、變性處理后經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，4℃將蛋白經(jīng)2～3 h電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。置膜于含50 g/L脫脂牛奶中(三羥甲基氨基甲烷-吐溫20鹽酸緩沖液稀釋)封閉1 h，分別加入特異性兔抗大鼠CTGF單克隆抗體（1∶1000稀釋）及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠多克隆抗體（1∶5000稀釋）進(jìn)行免疫反應(yīng)，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色，超敏膠片曝光，以GAPDH為內(nèi)參照。

1.4.6CTGFmRNA表達(dá)量檢測(cè) 采用半定量RT-PCR（reverse transcripition-PCR,RT-PCR）法。PCR引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)小鼠CTGF（又稱fisp-12）mRNA序列（GeneBank accession number:M70642）設(shè)計(jì) PCR引物，使用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 5.0版輔助設(shè)計(jì)。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

上 游 引 物 ：5′-GCCTACCGACTGGAAGACACATTT-3′；下游引物：5′-TTACGCCATGTCTCCGTACATCTT-3′，產(chǎn)物 810 bp。以 β-actin（478 bp）為內(nèi)對(duì)照，引物序列為：

5′-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′；

5′-ACTCATCGTACTCCTGTCTGCTGA-3′。

用Trizol法提取皮膚總RNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。CTGF PCR反應(yīng)條件：94℃1 min，45℃40 s，72℃40 s，共30個(gè)周期。PCR反應(yīng)條件：94℃1 min，48℃ 40 s，72℃ 50 s，共 26個(gè)周期。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶吸光度值，以待測(cè)基因/β-actin的比值作為待測(cè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.7 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) western blot及RT-PCR方法半定量檢測(cè)分析結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)果分析陽(yáng)性（顯色）條帶的分子質(zhì)量大小，經(jīng)Gel Doc1000凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描分析，計(jì)算機(jī)圖像灰度掃描數(shù)字轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)字處理。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間差異比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 真皮厚度及皮膚組織HYP含量測(cè)定 中藥組小鼠真皮厚度及HYP與模型組及生理鹽水組相比較降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與正常對(duì)照組及青霉胺組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 小鼠皮膚真皮厚度(μm)及HYP含量比較(μg，±s)

表1 小鼠皮膚真皮厚度(μm)及HYP含量比較(μg，±s)

注：與正常對(duì)照組、模型組相比較*△P<0.05；*△與青霉胺組相比較P>0.05。

組別 皮膚組織 HYP（μg）對(duì)照組 70.12±8.96模型組 112.23±11.62鹽水組 108.16±0.17中藥組 74.94± 2.81△青霉胺組 75.42± 1.25△△n 真皮厚度（μm）8 112.85±7.228 147.53±6.838 141.83±42.328 114.14±2.81*8 120.24±11.25**

2.2 western blot及RT-PCR結(jié)果 通過(guò)計(jì)算機(jī)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行CTGF蛋白及基因mRNA灰度分析，中藥組灰度值與生理鹽水組及模型組灰度值相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖 2、圖 3 和表2。

圖2 western blot分析不同刺激條件下CTGF表達(dá)

圖3 RT-PCR分析CTGFmRNA的表達(dá)：810bp；β－actin：478 bp

表2 小鼠皮膚組織CTGF蛋白及CTGF mRNA基因結(jié)果分析 (±s)

表2 小鼠皮膚組織CTGF蛋白及CTGF mRNA基因結(jié)果分析 (±s)

注：與生理鹽水組相比較*，**P<0.05；與青霉胺組相比較△，△△P>0.05。

組別 n CTGF蛋白 CTGF mRNA對(duì)照組 8 0.083±0.011 0.058±0.011模型組 8 3.912±0.028* 0.289±0.087鹽水組 8 3.417±0.036 0.238±0.082中藥組 8 1.061±0.022△ 0.089±0.026*青霉胺組 8 1.061±0.022△△ 0.094±0.013**

3 討論

硬皮病以局限性或彌漫性皮膚或伴有內(nèi)臟器官進(jìn)行性纖維硬化為特征。CTGF是一種與成纖維細(xì)胞分裂和膠原沉積密切相關(guān)的細(xì)胞因子，廣泛存在于人類多種組織器官，如肺臟、皮膚等及結(jié)締組織中。病理情況下，CTGF過(guò)度表達(dá)與硬皮病纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。Igarashi等[3]通過(guò)原位雜交檢測(cè)系統(tǒng)性硬皮病患者病變組織，發(fā)現(xiàn)在病變皮損處有強(qiáng)陽(yáng)性CTGF mRNA的表達(dá)，然而同一患者的正常皮膚標(biāo)本中則無(wú)表達(dá)。Querfeld等[4]認(rèn)為CTGF在硬皮病中高表達(dá)持續(xù)至硬化晚期，且表達(dá)程度與硬化程度正相關(guān)；國(guó)內(nèi)學(xué)者高地等[5]研究發(fā)現(xiàn)CTGF可使正?？寺B I型前膠原mRNA水平上升。因此CTGF被認(rèn)為是代表硬皮病纖維化程度的標(biāo)記物，可作為治療硬皮病的靶分子[6-7]。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)將硬皮病歸屬于“皮痹”、“皮痹疽”等范疇?！氨浴北疽庵傅氖恰白栝]不通”的意思，發(fā)病病機(jī)大都認(rèn)為與陽(yáng)氣不足、衛(wèi)外不固、風(fēng)寒濕邪乘隙侵入，營(yíng)衛(wèi)不和、氣血凝滯，經(jīng)絡(luò)阻隔，痹塞不通所致，所以“陽(yáng)虛、寒凝、血瘀”是發(fā)病的關(guān)鍵[8-9]，溫陽(yáng)散寒活血化瘀是治療硬皮病的基本治則[10]。溫陽(yáng)除痹湯是陜西省中醫(yī)院治療硬皮病的經(jīng)驗(yàn)方，具有活血化瘀、溫陽(yáng)散寒、溫通經(jīng)絡(luò)的功效，方中黃芪、仙茅、仙靈脾益氣健脾溫陽(yáng)補(bǔ)腎，當(dāng)歸、赤芍、桃仁、紅花養(yǎng)血活血疏通經(jīng)脈，莪術(shù)、穿山甲破血化瘀除痹，一味丹參功同四物，全方重在活血化瘀，溫陽(yáng)補(bǔ)腎，經(jīng)多年的臨床實(shí)踐，療效較為顯著[11]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桃仁具有改善血液流變學(xué)、抗炎、抗過(guò)敏等作用；桃仁、當(dāng)歸、赤芍、丹參等有明顯的抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成的作用[12-14]；體外實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)有明顯抑制硬皮病皮損成纖維細(xì)胞的增殖作用[15]；另?yè)?jù)研究，丹參不但抑制硬皮病皮損FB增殖，還降低Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的表達(dá)，促進(jìn)膠原酶mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)正常FB的凋亡[16]。因此中藥復(fù)方溫陽(yáng)除痹湯從組方特點(diǎn)來(lái)看具有擴(kuò)張血管、抑制成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究溫陽(yáng)除痹湯對(duì)硬皮病小鼠模型的治療作用。通過(guò)小鼠真皮厚度及羥脯氨酸含量的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)中藥組小鼠真皮厚度及羥脯氨酸含量明顯改善。western blot及RT-PCR電泳圖觀測(cè)提示CTGF蛋白、基因mRNA在正常小鼠皮膚中幾乎不表達(dá)，在模型組和生理鹽水組有較高表達(dá)，在中藥組和青霉胺組中有極少表達(dá)，說(shuō)明溫陽(yáng)除痹湯具有改善硬皮病皮膚組織纖維化的作用，溫陽(yáng)除痹湯可以降低CTGF蛋白和CTGF基因mRNA在硬皮病中的表達(dá)，即從基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平抑制CTGF蛋白產(chǎn)生，從而發(fā)揮其抗纖維化作用，治療效果與青霉胺大致相同，這與我們前期的研究結(jié)果相符合[17]。溫陽(yáng)除痹湯的抗纖維化作用為尋找有效治療硬皮病的藥物提供了新的啟示。但中藥復(fù)方溫陽(yáng)除痹湯具有的其他可能作用機(jī)制如對(duì)膠原酶表達(dá)的影響等，尚需進(jìn)一步探討。

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