任金平 ，王平 ，王媚 ，倪亞杰

（1.浙江中醫(yī)藥大學，杭州310053；2.浙江省杭州市第三人民醫(yī)院，杭州310009）

皮膚色素沉著臨床十分普遍，嚴重者損容，給患者帶來很大的心理負擔，影響患者生活質(zhì)量。日光中的中波紫外線被認為是引起皮膚色素沉著的主要原因。由于色素沉著的發(fā)病機制至今仍未完全闡明，盡管臨床上治療方法層出不群，但一直缺乏起效較快、有效率高、不良反應(yīng)小、復(fù)發(fā)率低的治療方法。近年來中藥對皮膚色素沉著的改善作用引起廣泛關(guān)注，臨床上外用中藥美白制劑治療黃褐斑等皮膚色素沉著有效，七白膏就是其中具有代表性的的一個。本研究選擇七白膏，應(yīng)用于中波紫外線誘導(dǎo)的皮膚色素沉著動物模型，通過觀察黑色素指數(shù)、黑素細胞及黑素顆粒變化，來客觀評價藥物的治療作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 采用普通級健康雄性棕黃色豚鼠10只，10周齡，體質(zhì)量240～260 g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，委托該中心飼養(yǎng)。每只實驗豚鼠背部取4塊相離的區(qū)域，紫外線光療儀建模后分別外涂藥物。

1.1.2 藥物 中藥七白膏由白術(shù)、白芷、白芨、白蘞、白附子、白茯苓、細辛外加雞子白組成[1]，各味中藥均購自江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司，委托專業(yè)藥師進行質(zhì)量鑒定，經(jīng)杭州市第三人民醫(yī)院制劑室制成乳膏制劑；2%氫醌乳膏購自廣東人人康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20040088，生產(chǎn)批號20110503；白術(shù)單體乳膏和單基質(zhì)乳膏由杭州市第三人民醫(yī)院制劑室制作。

1.1.3 儀器 SS-04B型紫外線光療儀（上海希格瑪高技術(shù)有限公司）；MPA9型皮膚多功能生理測試儀（德國CK公司）；皮膚共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)，美國微維VIVASCOPE 1500型，波長830 nm，最大輸出16.0 mW；黑素染色試劑盒（產(chǎn)品編號MST-8015）購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色素沉著模型制作 使用SS-04B型紫外線光療儀。照光前電動剃毛刀將豚鼠背部棕黃色長毛剃除，再以女用脫毛膏脫去短毛以充分裸露背部皮膚。紫外線光療儀正對豚鼠皮膚距皮膚15 cm左右，根據(jù)文獻[2]每次照射能量為500 mJ/cm2，隔日1次，共3次。每次照射后豚鼠皮膚可出現(xiàn)輕度發(fā)紅，但無腫脹，無水皰、血皰。

1.2.2 動物分組和給藥 每只實驗豚鼠背部取4塊相離區(qū)域，于建模成功后分別給予七白膏藥膏、2%氫醌乳膏、白術(shù)單體和單基質(zhì)乳膏外涂，2次/d，持續(xù)4周，用藥過程中每隔3天脫毛1次。

1.2.3 黑色素指數(shù)測定 應(yīng)用MPA9型皮膚多功能生理測試儀，于建模前后和用藥4周后分別測定豚鼠背部各區(qū)域皮膚黑色素指數(shù)變化。

1.2.4 活體下黑色素及黑素細胞觀察 應(yīng)用CLSM，實時動態(tài)觀察建模前后和用藥4周后豚鼠背部各區(qū)皮膚黑色素和黑素細胞的變化情況。

1.2.5 組織病理觀察 豚鼠皮膚常規(guī)石蠟切片，F(xiàn)eSO4染色，光鏡下觀察黑色素含量的變化。每張切片隨機取5個高倍鏡視野運用病理圖像分析儀對黑素顆粒進行計數(shù)統(tǒng)計，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，各組間采用t檢驗進行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件作數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 皮膚顏色變化 SS-04B型紫外線光療儀照射（總能量1500 mJ/cm2）豚鼠背部皮膚。照射結(jié)束后1 d皮膚出現(xiàn)輕微紅斑，3 d后出現(xiàn)脫屑，5～7 d后出現(xiàn)色素沉著，照射結(jié)束1周后色素沉著達頂峰且穩(wěn)定，然后開始外用藥物。七白膏實驗組用藥過程中未見明顯紅斑、脫屑等不良刺激，用藥4周后色素沉著顯著減退；2%氫醌組，用藥4～6 d皮膚出現(xiàn)發(fā)紅、脫屑，4周后色素沉著明顯減退；白術(shù)單體組用藥過程中未見發(fā)紅、脫屑，用藥4周后色素減退不明顯；單基質(zhì)組4周后未見明顯色素減退。

2.2 黑色素指數(shù)比較

2.2.1 照光前和3次照光結(jié)束后1周黑色素指數(shù)比較 紫外燈照射后皮膚黑色素指數(shù)較照射前顯著升高（P<0.01），見表1。

表1 照光前后豚鼠皮膚黑色素指數(shù)比較 （±s）

表1 照光前后豚鼠皮膚黑色素指數(shù)比較 （±s）

注：與照光前比較，*P<0.01。

組別 n 黑色素指數(shù)照光前 40 170.00±60.36照光后 40 352.50±91.35*

2.2.2 用藥前后各組黑色素指數(shù)比較 單基質(zhì)乳膏外用4周后，黑色素指數(shù)較用藥前無明顯變化（P>0.05）；白術(shù)單體外用4周后，黑色素指數(shù)較用藥前變化不明顯（P>0.05）；2%氫醌乳膏連用4周后，黑色素指數(shù)較用藥前顯著下降（P<0.01），七白膏組連用4周后，黑色素指數(shù)較用藥前顯著下降（P<0.01）。白術(shù)單體組與單基質(zhì)乳膏組相比黑色素指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；2%氫醌組與單基質(zhì)乳膏組相比黑色素指數(shù)明顯下降（P<0.01），較白術(shù)單體組明顯下降（P<0.01）；七白膏組與單基質(zhì)乳膏組相比黑色素指數(shù)顯著下降（P<0.01），與白術(shù)單體組相比明顯下降（P<0.01）但與2%氫醌組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 藥物干預(yù)前后各組皮膚黑色素指數(shù)比較 （±s）

表2 藥物干預(yù)前后各組皮膚黑色素指數(shù)比較 （±s）

注：*P<0.01；△P>0.05。

組別n 藥物干預(yù)前 藥物干預(yù)后單基質(zhì)乳膏組 10白術(shù)單體乳膏組 10 353.30±101.62 322.60±85.63△344.00± 86.97 323.20±85.06△2%氫醌乳膏組七白膏組1010354.70± 87.41 208.90±66.54*358.00±101.34 203.20±63.43*

2.3 CLSM觀察造模前后及藥物干預(yù)前后各組黑素細胞及黑素顆粒的變化 紫外線光療儀照射后，CLSM下豚鼠表皮基底層可見大量樹枝狀黑素細胞及色素顆粒，黑素細胞功能活躍；與治療前相比，單基質(zhì)乳膏組和白術(shù)單體組外用4周后，黑素細胞和色素顆粒未見明顯變化，而2%氫醌組與七白膏組樹枝狀黑素細胞數(shù)量及色素顆粒明顯減少。見圖1。

圖1 CLSM下黑素細胞和色素顆粒改變

2.4 組織病理學觀察 紫外線光療儀照射后各區(qū)域皮膚黑素顆粒顯著增多；單基質(zhì)乳膏組使用4周后未見明顯黑素顆粒減少跡象；白術(shù)單體組連續(xù)用藥4周后黑素顆粒減少不明顯；2%氫醌組連續(xù)應(yīng)用4周，黑素顆粒較外用單基質(zhì)乳膏組明顯減少；七白膏組外用4周后黑素顆粒較單基質(zhì)乳膏組明顯減少。見圖2。組織切片中黑素顆粒計數(shù)結(jié)果見表4。

圖2 照光后及用藥4周后各組皮損組織病理像（F e S O4染色 ×100）

表4 組織切片中黑素顆粒計數(shù)分析

3 討論

皮膚色素沉著是皮膚科常見的一類疾病，易診難治，嚴重影響患者生活質(zhì)量和心理健康。日光中的中波紫外線輻射越來越受到關(guān)注。近年來UVB照射豚鼠構(gòu)建色素沉著實驗動物模型已被成功應(yīng)用[3]。根據(jù)文獻資料[2]，豚鼠UVB的最小紅斑量為200～300 mJ/cm2，采用局部雙倍最小紅斑量的紫外線劑量（500 mJ/cm2）分次間歇照射棕黃色豚鼠的方法,既減少紅斑水皰的發(fā)生,又可形成穩(wěn)定均勻的色素沉著,便于實驗中觀察和數(shù)據(jù)記錄。本研究選擇單次500 mJ/cm2，總劑量1500 mJ/cm2的方法所形成的色素沉著均勻、穩(wěn)定。

皮膚色素沉著的治療一直是困擾醫(yī)生和患者的一個難題，盡管治療方法很多，但缺乏一種療效確切、不良反應(yīng)小、不易復(fù)發(fā)的治療方法。氫醌是較經(jīng)典的皮膚脫色劑，外用可引起局部皮膚紅斑、脫屑瘙癢和刺痛等不良刺激，刺激性與濃度及接觸時間有關(guān)[4]。研究表明黑素細胞過度增殖和黑素合成進行性增多是導(dǎo)致色素沉著發(fā)生或加重的重要因素[5]，抑制黑素細胞增殖和黑素合成可減少皮膚色素沉著的發(fā)生和發(fā)展。理想的皮膚脫色劑是能直接或間接抑制黑素細胞增殖和黑素合成，脫色迅速且無明顯不良刺激、不易復(fù)發(fā)的制劑。近年來隨著祖國醫(yī)藥的現(xiàn)代化開發(fā)應(yīng)用，一大批經(jīng)方顯現(xiàn)出其獨特的優(yōu)勢，七白膏就是其中具有代表性的一個方劑，中藥七白膏源自宋代太平圣惠方[1]，主要由白術(shù)、白芷、白芨、白蘞、白附子、白茯苓、細辛外加雞子白組成，張建華等[6]對不同文獻的“七白膏”中涉及的10味中藥分別進行萃取，體外觀察各提取物對黑素細胞增殖及黑素合成的影響，發(fā)現(xiàn)10味中藥提取物對黑素細胞增殖和黑素合成均有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)七白膏能有效抑制黑素細胞增殖和黑素合成，從而減輕皮膚色素沉著，且在用藥過程中不會出現(xiàn)類似氫醌的紅斑、脫屑等不良刺激。

綜上所述，外用經(jīng)方七白膏治療皮膚色素沉著的療效與氫醌相當，能顯著抑制黑素細胞活性和減少黑素顆粒的產(chǎn)生，但對皮膚的刺激性很小或幾乎無刺激，尤其適合于黃褐斑、炎癥后色素沉著等色素增加性皮膚病的防治，是比較理想的脫色劑，值得深入研究并推廣應(yīng)用于臨床。

［1］王懷隱.太平圣惠方[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1982:1200-1235.

［2］ Tobiishi M,Haratake A,Kaminaga H,et al.Pigmentation in intrinsically aged skin of A1 guinea pigs[J].Pigment Cell Res,2004,17:651-658.

［3］ Maeda K,Naganuma M.Topical trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid prevent ultraviolet radiation-induced pigmentation[J].J Photochem Photobiol B,1998,47:136-141.

［4］Mauricio T,Karmon Y,Khaiat A.A randomized and placebocontrolled study to compare the skin-lightening efficacy and safety of lignin peroxidase cream vs.2%hydroquinone cream[J].J Cosmet Dermatol,2011,10:253-259.

［5］ Jeon S,Kim NH,Koo BS,et al.Bee venom stimulates human melanocyte proliferation,melanogenesis,dendricity and migration[J].Exp Mol Med,2007,39:603-613.

［6］張建華，王婷，李華，等.七白膏各中藥萃取物對黑素細胞增殖及黑素合成的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志，2009，43（1）：84－86.