黃忠輝，滕偉，陳盈，王琴梅

1 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點實驗室，廣東 廣州 510080

2 中山大學(xué)附屬光華口腔醫(yī)院，廣東 廣州 510080

血管新生是指在已有血管結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，形成新血管網(wǎng)的生物過程。血管新生的機理比較復(fù)雜，諸多促進新生的因素中包括血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF)等的調(diào)控作用[1]。通過基因治療的方法來調(diào)控 VEGF和bFGF的水平，具有作用特異性強、不良反應(yīng)輕等優(yōu)點[2-3]，在臨床上有重大的研究和應(yīng)用意義。

然而，目前的基因治療研究多集中于提高報告基因體外轉(zhuǎn)染癌細胞的效率[4-6]，對治療基因進行體內(nèi)實驗的研究較少。我們已證實氧化海藻酸接枝低分子量聚乙烯亞胺 (Alginategraft-PEI，Alg-g-PEI)(圖 1)能在體外介導(dǎo)VEGF質(zhì)粒 (pVEGF)轉(zhuǎn)入大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞 (Rat mesenchymal stem cells, rMSCs)，表達出有效治療劑量的VEGF，同時表現(xiàn)出較低的細胞毒性。在此基礎(chǔ)上，本研究通過模擬體內(nèi)條件驗證 Alg-g-PEI能否有效保護 DNA，并以雞胚和斑馬魚為動物模型，進一步探索Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物在體內(nèi)促進血管新生的作用，為該載體下一步的大動物實驗及未來的臨床應(yīng)用提供理論和實踐依據(jù)。

圖1 Alg-g-PEI的化學(xué)結(jié)構(gòu)[7]Fig. 1 Chemical structure of Alg-g-PEI[7].

1 材料與方法

1.1 材料

Alg-g-PEI：本實驗室自制，分子量17 000 Da，氮含量 23.3%；血管內(nèi)皮生長因子真核表達質(zhì)粒 (pVEGF)受贈于廣東省人民醫(yī)院；胎牛血清購自Hyclone公司；Alamar Blue購自廣州國奧生物有限公司；5日齡受精種蛋購自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧研究所；甲基纖維素 (Methyl cellulose,MC, 188042)購自 Sigma公司；血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚 (Flk-1)由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實驗室惠贈；斑馬魚培養(yǎng)液 (Holtbuffer)的配方(1 L)：NaCl 3.5 g；KCl 0.05 g；NaHCO30.025 g；CaCl20.1 g，加入雙蒸水充分溶解。

凝膠電泳儀 (電泳儀DYY-6C型)；凝膠圖像分析儀 (GAS7001X，UVITEC)；雞胚孵化箱(型號HH.B11.260-TBS，上海躍進醫(yī)療器械廠)；體視顯微鏡 (Nikon AZ100)。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合物的制備

將pVEGF稀釋至40 ng/μL，根據(jù)所需N/P配制不同濃度的Alg-g-PEI或PEI 25K水溶液，pVEGF與Alg-g-PEI或PEI 25K等體積混合后渦旋 3～5 s，室溫靜置 30 min，自組裝形成Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物，立即使用。

1.2.2 細胞毒性檢測

常規(guī)分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rMSCs)[8]。在有血清 (10%)條件下，使用Alamar Blue法[9-10]測定 N/P分別為 60、90、110的Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物對rMSCs的毒性，復(fù)合物在培養(yǎng)基中所占體積分數(shù)為10%。以PEI 25K/pVEGF (N/P=10)為陽性對照，無復(fù)合物干預(yù)的細胞存活率為100%對結(jié)果進行標準化，計算細胞存活率 (n=3)。

1.2.3 Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物耐肝素置換能力

制備濃度分別為 10、12、16、18、20、50 mg/mL的肝素水溶液各10 μL，分別加入10 μL Alg-g-PEI與pVEGF質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物 (Alg-g-PEI/pVEGF, N/P=60)溶液，共孵育15 min或2 h 后，取樣行凝膠電泳分析[7]。

1.2.4 Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物耐 DNaseⅠ酶降解作用

取8 μL Alg-g-PEI與pVEGF質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物 (Alg-g-PEI/pVEGF，N/P=60)溶液，與2 μL 1 U DNaseⅠ或PBS混合，37 ℃孵育0.25、0.5、2、4、8、12、24 h (加 PBS 的孔僅孵育 6 h)后，加入 5 μL 100 mmol/L EDTA，37 ℃孵育10 min使DNase I酶失活，再加入10 μL 12 mg/mL肝素溶液，室溫孵育 2 h使pVEGF和 Alg-g-PEI充分解離，取樣進行凝膠電泳分析，以未經(jīng)酶處理的裸pVEGF、DNase I處理的裸pVEGF為對照。

1.2.5 Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物耐血清能力

取10 μL Alg-g-PEI與pVEGF質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物 (Alg-g-PEI/pVEGF，N/P=60、90、110)溶液，分別與等體積新鮮血清 (50%)混合，37 ℃孵育3、6、12、24、48 h后，加入10 μL 12 mg/mL肝素溶液，室溫孵育2 h后，取樣進行凝膠電泳分析，以裸、血清同樣處理的裸pVEGF、未加血清但同樣孵育處理的復(fù)合物為對照。

1.2.6 Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物促進 CAM 血管生成作用

配制5%的甲基纖維素 (MC)水溶液，高壓蒸汽滅菌后，將 160 μL 溶液分 4次 (50、50、30、30 μL)加入 96 孔板中，每次加完后在 (60±3)℃的烘箱中烘1 h，最后從96孔板中小心挑出MC膜，置于紫外燈下照射30 min滅菌，備用。

參考賀國安等[11]的方法培養(yǎng)雞胚種蛋，在(38±0.5)℃、濕度40%～70%的孵化箱中孵育到第 7天，選擇發(fā)育正常的雞胚開窗。將雞胚隨機分為9組： PEI 25K/pVEGF (N/P=10)陽性對照組、生理鹽水空白對照組、N/P=90的空載體對照組、0.4 μg的裸 pVEGF對照組，Alg-g-PEI/pVEGF (N/P=90)中分別含 0.4、0.8、1.2、1.6、2.4 μg DNA的實驗組。雞胚開窗揭去氣室膜暴露CAM，將MC膜置于CAM 中央血管稀少區(qū)，再將 50 μL樣品溶液分別用移液槍滴加到 MC膜里，用無菌的透明膠帶封貼氣室端。繼續(xù)常規(guī)孵育72 h后，于膜表面加入3～5 mL冰冷的固定液 (甲醇和丙酮等體積混合)固定30 min，用眼科剪小心剪下整塊血管膜，在盛有固定液的培養(yǎng)皿中小心攤開，使膜平貼于培養(yǎng)皿表面，置于體視顯微鏡下觀察和拍照。照片使用image-pro plus 6.0分析軟件進行處理[12]，以加樣位置為中心建立一個20×20 cm2的固定選區(qū)，對選區(qū)內(nèi)的血管面積進行計算，最后計算血管面積和CAM選區(qū)面積的比值 (VA/CAM)[13]。

1.2.7 復(fù)合物對斑馬魚的毒性及促血管生成作用

按標準方法養(yǎng)殖和繁殖斑馬魚[14-15]，將健康成熟的斑馬魚按雌雄 1/2的比例放入交配魚缸中，次日搜集受精魚卵。

將健康的新生受精魚卵置于24孔板中，每孔30個，加入1 mL Holtbuffer。24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，再分別加入N/P為45、60、90、110的Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物水溶液100 μL，以PEI 25K/pVEGF (N/P=10)為陽性對照，未處理的受精魚卵為空白對照。共孵育一定時間后，評價其毒性和促血管生成作用。

毒性實驗：對復(fù)合物干預(yù)后的斑馬魚觀察96 h (隔6 h一次)，記錄死亡例數(shù)和時間。使用Graphpad Prism 5.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，作Kaplan-Meier生長曲線，與陽性對照組比較，記錄P值。

促血管生成實驗：在72 h后 (干預(yù)后48 h)將斑馬魚用 10%多聚甲醛固定后，置于體視顯微鏡下觀察腸下血管新生情況，拍照后使用NIH Image 圖像處理軟件對腸下血管面積和長度進行定量分析[16-17]。

1.2.8 結(jié)果處理

如無特別說明，所有結(jié)果均取 3次實驗平均值，應(yīng)用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 (x±s)表示，組間比較采用t檢驗，**P＜0.01和*P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞毒性檢測

Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物水溶液在有血清條件下對rMSCs毒性很低 (圖 2)，細胞存活率均在80%以上；當(dāng)N/P=60、90時，Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物與細胞接觸4 h后基本無毒性，48 h后細胞存活率仍然高于 80%，分別為(84.61±3.15)%和 (82.62±1.97)%，大于陽性對照組 (26.03±4.06)%(**P＜0.01)；當(dāng) N/P=110時，隨著孵育時間的增加細胞存活率下降，但48 h后存活率仍保持 (72.39±2.84)%，而陽性對照組的細胞存活率一直低于50%。

2.2 Alg-g-PEI對pVEGF的保護作用

圖2 rMSCs和聚合物/pVEGF復(fù)合物在有血清 (10%)條件下共孵育后的細胞存活率 (與 PEI 25K 組相比**P＜0.01)Fig. 2 Cell viability of rMSCs after incubation with polymer/pVEGF complexes in 10% serum. **P<0.01 vs PEI 25K group.

肝素競爭置換實驗結(jié)果表明，肝素濃度為12 mg/mL時，孵育 15 min能夠置換出部分pVEGF，孵育2 h后能完全置換出pVEGF (圖3A)。而10 mg/mL的肝素孵育2 h后仍不能完全置換出pVEGF。復(fù)合物耐DNase I酶解實驗顯示，裸VEGF與酶接觸0.5 h后已完全降解，而Alg-g-PEI和pVEGF復(fù)合后，當(dāng)酶解時間小于 4 h時，肝素置換出的 DNA條帶與未處理pVEGF條帶的亮度接近；酶解時間大于4 h，部分pVEGF被酶解，置換后的條帶亮度下降，條帶不清晰 (圖3B)。在耐血清實驗中，裸pVEGF和血清共孵育3 h后部分被降解，6 h后完全降解 (圖 3C，泳道 2)。相比之下，有 Alg-g-PEI保護的pVEGF能夠在48 h內(nèi)免受血清的降解，肝素置換pVEGF后，電泳條帶的亮度、形狀與裸DNA接近，48 h后N/P=110、90的復(fù)合物仍能很好地保護ppVEGF (圖 3C)。

2.3 Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物促進 CAM 血管生成作用

如圖 4所示，在顯微鏡下可觀察到實驗組血管 (圖 4C)比空白對照組(圖 4A)和陽性對照組 (圖4B)多，表現(xiàn)為分支增多，血管密度和直徑增大?？瞻捉M的血管保持正常CAM的葉脈狀自然生長，血管整體分布均勻。陽性對照組的血管較實驗組的稀疏，但比空白組密。定量計算結(jié)果 (表1)表明，實驗組VA/CAM為44.4%，明顯高于陽性對照組 (35.9%)和空白對照組(24.03%)(**P＜0.01)，且具有劑量依賴性。

2.4 復(fù)合物對斑馬魚的毒性及促血管生成作用

圖3 Alg-g-PEI/pDNA在不同溶液中孵育一定時間后對pDNA的保護能力 (A為耐肝素競爭置換，B為耐DNaseⅠ酶解，C為耐血清降解：1、2、3泳道分別是裸pVEGF、pVEGF和50%血清共孵育、Alg-g-PEI/pVEGF和PBS共孵育)Fig. 3 Protection of Alg-g-PEI to pVEGF against pVEGF heparin (HEP)(A), DNase I (B)and serum (50%)(C).1: naked pVEGF; 2: pVEGF incubated with serum (50%); 3: Alg-g-PEI/pVEGF incubated with PBS.

圖4 Alginate-Graft-PEI/pVEGF復(fù)合物對CAM血管新生的影響 (A為空白對照組，B為PEI 25K組(N/P=10，DNA含量為2.4 μg)，C為Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物組 (N/P=90，DNA含量為2.4 μg))Fig. 4 Effect of Alginate-Graft-PEI/pVEGF on angiogenesis of chick embryo chorioallantoic membrane. (A)Blank group. (B)CAM treated by PEI 25K containing 2.4 μg DNA (N/P=10). (C)CAM treated by Alg-g-PEI/pVEGF complexes containing 2.4 μg DNA (N/P=90).

表1 不同樣品處理后的CAM血管面積 (VA/CAM,x±s)Table 1 Vessel area in CAM treate by different samples (VA/CAM,x±s)

圖5 不同氮磷比Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物與斑馬魚胚胎共培養(yǎng)的Kaplan-Meier生長曲線Fig. 5 Kaplan-Meier survival curves of zebrafish embryos after incubation with Alg-g-PEI/pVEGF complexes at various N/P ratios. P-value vs PEI/pVEGF at N/P=10.

如圖 5所示，在所研究范圍內(nèi)，Alg-g-PEI/pVEGF對斑馬魚受精卵基本無毒性。當(dāng) N/P＜110，斑馬魚生存曲線平穩(wěn)，96 h 后斑馬魚的生存率均在 75%以上，毒性明顯低于 PEI 25K/pVEGF (N/P=10)，且差異顯著。而N/P=110時，毒性較大，96 h后的生存百分率低于60%(圖5D)。在促斑馬魚血管生成實驗中，在顯微鏡下可觀察到 Alg-g-PEI組 (圖 6C～F)血管分支明顯多于空白對照組 (圖6A)和PEI 25K對照組 (圖6B)，且腸下血管整體較長、血管面積較大。Alg-g-PEI組和PEI組均見釘突樣血管新生現(xiàn)象 (圖 6箭頭處)，空白組血管保持正常生長，整體分布均勻 (圖 6A)。對腸下血管面積和血管整體長度進行計算后作圖 (圖 6G，H)，發(fā)現(xiàn)Alg-g-PEI組與空白對照組和陽性對照組相比較均有顯著性差異 (**P＜0.01，*P＜0.05)，當(dāng)N/P=110時，血管總長度和面積分別為1.11 mm和 1.70×103像素；N/P=90時，為 1.01 mm 和1.65×103像素；均明顯大于 PEI 25K 對照組(0.82 mm、1.11×103像素)(**P＜0.01)。

圖6 不同氮磷比Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物對斑馬魚血管生成作用的定性 (C～F)與定量 (G，H)分析 (A、B分別為空白對照組和PEI 25K/pVEGF (N/P=10)陽性對照組，白色箭頭處為釘突樣血管，**P＜0.01，*P＜0.05)Fig. 6 Effects of Alg-g-PEI/pVEGF on the angiogenesis of zebrafish embryos at various N/P ratios (C–F). (A)Nontreated zebrafish. (B)Zebrafish treated with PEI 25K/pVEGF (N/P=10). Quantization of length and area of subintestinal vessels (G, H)in zebrafish embryos. White arrows are vessels assembling spikes. **P<0.01; *P<0.05.

3 討論

基因載體是基因治療中不可缺少的一部分，病毒載體因為不易大批量生產(chǎn)、DNA裝載量少、安全性不高等原因并沒有得到廣泛的臨床應(yīng)用[18]。鑒于基因治療的無限潛能，人們將注意力轉(zhuǎn)到陽離子非病毒載體，但與病毒載體相比，陽離子聚合物轉(zhuǎn)染效率較低，因此如何提高轉(zhuǎn)染效率并降低毒性成為急需解決的問題。本課題組用低分子量的 PEI 1.8K和可降解的氧化海藻酸鈉接枝，合成出 Alg-g-PEI，體外轉(zhuǎn)染實驗表明它對不同細胞均有較高轉(zhuǎn)染效率和較低的細胞毒性[7]。為了探索Alg-g-PEI在體內(nèi)條件下是否依然具備低毒性和高轉(zhuǎn)染能力，本研究模擬體內(nèi)條件，先考察了 Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物對rMSCs的毒性，結(jié)果顯示復(fù)合物在有血清條件下對 rMSCs基本無毒性 (圖 2)。當(dāng) N/P＜110時，復(fù)合物與rMSCs孵育48 h后，細胞仍然具有較高存活率 (大于 80%)，明顯高于 PEI 25K (**P＜0.01)，初步證明Alg-g-PEI在體內(nèi)有血清條件下轉(zhuǎn)染的安全性。體內(nèi)轉(zhuǎn)染時，陰離子多糖對 pDNA的競爭置換及體內(nèi)血清中非特異性酶、內(nèi)切酶等對外源DNA的降解是轉(zhuǎn)染的主要障礙，因此體內(nèi)轉(zhuǎn)染要求載體/pDNA復(fù)合物具有穩(wěn)定性，能夠有效保護pDNA在傳遞過程中以及到達靶細胞之后免遭核酸酶等的降解[19-20]。本研究以VEGF質(zhì)粒作為實驗DNA，通過耐肝素陰離子置換、耐 DNaseⅠ酶和血清實驗考查Alg-g-PEI對 DNA的保護作用，結(jié)果表明，pVEGF與Alg-g-PEI復(fù)合后，肝素 (12 mg/mL)需要2 h完全置換pVEGF (圖3A)；DNaseⅠ酶需要24 h完全降解p pVEGF (圖3B)；血清則在48 h內(nèi)仍不能完全降解pVEGF (圖3C)，而無保護的pVEGF在0.5 h就已被DNase I酶解完全；6 h被血清降解完全。說明Alg-g-PEI/pVEGF對pVEGF具有較好保護作用，預(yù)示了 Alg-g-PEI體內(nèi)轉(zhuǎn)染的可行性。

本研究選擇 CAM 模型作為體內(nèi)轉(zhuǎn)染促進血管生成的模型，主要因為CAM操作性強、可信度高、實驗結(jié)果易于觀察、指標明確、結(jié)果易于定量，適合促血管生成藥物高通量初篩[21-22]。我們選擇7 d的雞胚進行開窗加樣，是因為CAM血管網(wǎng)絡(luò)在這個時期形成的速度比較穩(wěn)定，雞胚生命力旺盛，CAM 血管發(fā)育穩(wěn)定[23]；雞胚早期免疫系統(tǒng)發(fā)育不全，對所加測試藥物無強烈排斥反應(yīng)[21]，對實驗結(jié)果影響較小。選擇MC膜作為載藥模具，是因其質(zhì)地光滑、質(zhì)量輕、生物相容性好、48 h左右降解消失，與濾紙片、瓊脂糖片及塑料蓋玻片相比較，具有較大優(yōu)勢[24-25]。

在前期研究中，我們先固定pVEGF用量為1.2 μg，考察不同N/P比復(fù)合物對CAM血管生成的促進作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)N/P=90時，復(fù)合物具有最佳促進血管生成作用，然后固定N/P=90，觀察血管生成的pVEGF劑量的依賴性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)pVEGF用量為2.4 μg/CAM時，促血管生成作用最明顯，VA/CAM為44.4%，高于陽性對照組 (35.9%)和空白對照組 (24.03%)。說明 Alg-g-PEI在體內(nèi)環(huán)境下能夠成功將目的基因?qū)氲郊毎?，并表達出能夠促進局部血管生成的蛋白量，且蛋白量可通過劑量調(diào)控。

為進一步驗證 Alg-g-PEI/pVEGF在體內(nèi)的安全性和有效性，我們考察了 Alg-g-PEI對Flk-1斑馬魚胚胎的毒性和血管新生的促進作用。與大鼠等模型相比，斑馬魚具有與人類在血管發(fā)育過程中的基因及信號通路有高度同源性、成本低適合高通量篩選、易于觀察、指標容易定量等特點，被廣泛應(yīng)用于血管發(fā)生機制研究及促血管新生相關(guān)藥物的篩選[26]。斑馬魚的Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果 (圖 5)顯示，當(dāng)N/P=45、60、90，Alg-g-PEI/pVEGF幾乎不影響斑馬魚的存活與發(fā)育，斑馬魚生存百分率 75%以上，與PEI 25K/pVEGF對照組相比*P＜0.05，說明體內(nèi)應(yīng)用時Alg-g-PEI/pVEGF具有低毒性。

因斑馬魚腸下血管由血管新生形成，且易操作、易定量，我們通過定性觀察和定量計算斑馬魚腸下血管長度、面積來探討Alg-g-PEI/pVEGF復(fù)合物對斑馬魚血管新生的促進作用。一般斑馬魚腸下血管呈籃子形狀，從體節(jié)的腹部邊緣往卵黃方向延伸，橫向長約 50～100 μm[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，Alg-g-PEI/pVEGF有效地促進了斑馬魚腸下血管新生，主要表現(xiàn)在：腸下血管網(wǎng)在體節(jié)方向延長超過150 μm；血管網(wǎng)整體面積增大；血管的直徑增大、分支增多；血管籃子底部有釘突樣血管生成 (圖 6箭頭處)。這說明VEGF得到了有效表達，斑馬魚實驗再一次證明了 Alg-g-PEI/pVEGF具有較低的毒性，并且能促進體內(nèi)血管生成。

總之，本研究通過系列實驗證明了Alg-g-PEI與pVEGF復(fù)合后對rMSCs和斑馬魚都具有較低的毒性，且能有效保護 pDNA。Alg-g-PEI能介導(dǎo) pVEGF在組織細胞內(nèi)表達出治療量的VEGF，促進血管生成。預(yù)示Alg-g-PEI作為一種基因載體具有較好的應(yīng)用前景和開發(fā)潛力，我們將進一步研究Alg-g-PEI的轉(zhuǎn)染機制以及在大動物體內(nèi)促血管生成的量效、時效關(guān)系，為將來的臨床應(yīng)用提供更加充分的理論和實踐依據(jù)。

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