王睿，喻曉蔚，徐巖

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

脂肪酶 (EC 3.1.1.3)不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、轉(zhuǎn)酯化、酸解等反應(yīng)，被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、制藥、生物能源工業(yè)[1-2]及食品工業(yè)[3-4]中。根霉脂肪酶在脂肪酶體系中有重要地位。根霉屬主要包括微孢根霉Rhizopus microsporus、匍枝根霉 Rhizopus stolonifer和米根霉Rhizopus oryzae 3類，米根霉中又包括德式根霉Rhizopus delemar、爪哇根霉Rhizopus javanicus、雪白根霉Rhizopus niveus和少根根霉Rhizopus arrhizus。不同來(lái)源的根霉脂肪酶序列有所差異，但是它們都具有以下共同結(jié)構(gòu)特征：具有 а/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)特征；擁有Gly-X-Ser-X-Gly模體；催化三聯(lián)體由Ser-His-Asp/Glu被一個(gè)具有兩親性的肽環(huán)“蓋子”所覆蓋。當(dāng)脂肪酶在油一水界面時(shí)，肽環(huán)“蓋子”構(gòu)型發(fā)生改變，催化部位被暴露，底物與催化中心接觸而進(jìn)行反應(yīng)；穩(wěn)定性佳、轉(zhuǎn)化效率高等。目前已經(jīng)有超過(guò)30種商品化的根霉脂肪酶應(yīng)用于芳香酯、生物柴油、手性化合物的生產(chǎn)中[5-6]。

本研究室在前期研究中從釀造濃香型大曲酒的酒曲中篩選到一株華根霉[5]，從中克隆得到脂肪酶基因 proRCL[7]，并成功實(shí)現(xiàn)了脂肪酶r27RCL在畢赤酵母中的高效表達(dá)以及在發(fā)酵罐中的高密度表達(dá)[7-8]。但是，由于華根霉脂肪酶是中溫酶，熱穩(wěn)定性差[9]，高溫下的半衰期非常短[10-12]。這不僅限制了其應(yīng)用范圍，還增加了工業(yè)應(yīng)用成本，為實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)困難。因此，提高r27RCL的熱穩(wěn)定性至關(guān)重要。

定向進(jìn)化是提高酶的熱穩(wěn)定性最快捷而有效的方法。近 10年來(lái)，定向進(jìn)化技術(shù)已在脂肪酶熱穩(wěn)定性改造領(lǐng)域取得巨大成功。如：Kohno等利用易錯(cuò)PCR，將來(lái)自雪白根霉R. niveus的脂肪酶RNL的Tm值提高了10 ℃[13]。又如譚天偉等經(jīng)過(guò)易錯(cuò)PCR、DNA shuffling和篩選，使來(lái)自少根根霉R. arrhizus的脂肪酶RAL的最適溫度提高10 ℃，50 ℃下的半衰期提高為原來(lái)的12倍[14]。本研究利用易錯(cuò)PCR的方法向該酶中隨機(jī)引入突變，利用 PCR依賴型方法構(gòu)建華根霉脂肪酶基因突變文庫(kù)[15]，再結(jié)合fast-blue RR頂層瓊脂篩選方法，獲得了熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、PCR試劑 (TaKaRa寶生物公司)，引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)合成，DL2 000 DNA Ladder marker、E10 000 DNA Ladder marker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒 (天根生化科技 (北京)有限 公 司)，Plasmid Mini KitⅠ (OMEGA BIO-TEK)，Stirred Ultrafiltration Cell 8050 Ultrafiltration Membrane (Millipore Corporation，Bedford， U.S.A)， SP-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose 6 FF (Pharmacia 公司)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coli JM109、巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris GS115和華根霉Rhizopus chinensis CCTCCM201021由本實(shí)驗(yàn)室保存，攜帶華根霉脂肪酶基因 proRCL的重組質(zhì)粒pPIC9K-proRCL (本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)，.載體 pPIC9K購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖；

MD：1.34% YNB，4×10-5%生物素，2%葡萄糖；

BMMY：1%酵母膏，2%蛋白胨，1%甲醇，0.1 mmol/L pH 6.0 磷酸緩沖液，1.34% YNB，4×10-5生物素；

BMMYA’平板：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%甲醇，0.1 mmol/L pH 6.0磷酸緩沖液，1.34%YNB，4×10-5生物素，2%瓊脂；

Fast-blue RR頂層瓊脂：A：80 mg Fast-blue RR溶于1 mL二甲亞砜，B：20 mg萘酯溶于1 mL二甲基甲酰胺，取80 μL A液，180 μL B液和0.2 g瓊脂于15 mL蒸餾水中，加熱溶解備用。

1.2 方法

1.2.1 proRCL的易錯(cuò)PCR擴(kuò)增

以重組質(zhì)粒 pPIC9k-proRCL為模板，設(shè)計(jì)上、下游引物F和R (表1)。50 μL易錯(cuò)PCR體系如下：5 μL 10×易錯(cuò)PCR緩沖液(500 mmol/L KCl，70 mmol/L MgCl2，100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3，0.1%(W/V，明膠))；0.5 mmol/L dATP/dGTP，2.5 mmol/L dCTP和dTTP；引物F/R各40 pmol；MgCl27 mmol/L；MnCl20.3 mmol/L；Taq 2.5 U，超純水補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物命名為promRCL，經(jīng)DNA純化試劑盒純化備用。

1.2.2 表達(dá)載體pPIK9K的擴(kuò)增

以pPIC9K為模板，以9K-short F和9K-short R (表1)為引物，擴(kuò)增得到9K-short (2 000 bp)的短片段；同樣以引物 9K-long F和 9K-long R(表1)擴(kuò)增得到9K-long (7 226 bp)的長(zhǎng)片段。將擴(kuò)增片段9K-short和9K-long利用純化試劑盒純化后備用。

表1 本研究中用到的引物及其序列Table 1 The primers used in this study

1.2.3 基因突變文庫(kù)的構(gòu)建

利用 PCR依賴型方法構(gòu)建高質(zhì)量酵母基因突變文庫(kù)[15]。將9K-short和9K-long片段等摩爾混合，再與易錯(cuò) PCR擴(kuò)增得到的突變基因promRCL片段按照摩爾比1∶10混合，于干燥箱中濃縮至體積＜1 μL。將混合物電轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于MD平板上，30 ℃培養(yǎng)2 d，得到突變文庫(kù)。以第一輪篩選得到的目的菌株的基因組等摩爾混合物作為第二輪易錯(cuò)PCR時(shí)的模板。

1.2.4 熱穩(wěn)定性突變菌株的初步篩選

用滅菌牙簽將MD平板上生長(zhǎng)出的His+轉(zhuǎn)化子復(fù)制到Y(jié)PD和BMMYA’平板的相同位置，同時(shí)將對(duì)照菌GS115 pPIC9k-pro’接種至BMMYA’平板上。30 ℃培養(yǎng)5 d。

保存生長(zhǎng)完畢的YPD平板。將BMMYA’平板正置于60 ℃熱處理60 min，冰浴15 min，室溫平衡30 min。將15 mL新鮮配制的Fast-blue RR頂層瓊脂均勻傾倒于處理后的各板上。2 min內(nèi)顏色深于陽(yáng)性對(duì)照的菌株為初篩目的菌株。

1.2.5 初篩目的菌株的復(fù)篩與鑒定

向 1.8 mL/孔 (平底)的 96孔板中加入300 μL BMGY 培養(yǎng)基，121 ℃滅菌 20 min。向其中接入保藏于 YPD平板上的初篩目的菌株 (同時(shí)接入 GS115 pPIC9k-pro’作為對(duì)照)，30 ℃250 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為2～6 (約16～18 h)。離心，棄上清，用900 μL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，并加入1% (V/V)甲醇誘導(dǎo)脂肪酶表達(dá)。此后每 24 h補(bǔ)加 100 μL BMMY 培養(yǎng)基和 1%(V/V)甲醇，誘導(dǎo)3.5 d。

將誘導(dǎo)表達(dá) 84 h的 96孔板發(fā)酵液3 000 r/min離心10 min，收集上清，于60 ℃熱處理20 min，冰上放置15 min，室溫放置30 min平衡。取1 μL上清液稀釋500倍后，取5 μL于另一 96孔板中，用排槍加入底物，振蕩混勻。2 min內(nèi)迅速顯示明顯黃色的菌株為復(fù)篩目的菌株。相同條件下，對(duì)照菌 GS115 pPIC9k-pro’的發(fā)酵上清液不能顯示明顯黃色。

復(fù)篩目的菌株經(jīng)過(guò)基因的酶切和PCR驗(yàn)證后，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.6 脂肪酶的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化

將含有氨基酸突變的菌株，接種至 25 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng) 16～20 h至OD600為2～6，離心收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基稀釋至OD600為1，每隔24 h添加0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)3～4 d后，收集發(fā)酵上清液。

將突變菌株的發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)10 kDa超濾膜濃縮，SP-Sepharose FF強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析和Phenyl-Sepharose 6 FF疏水色譜柱層析后得到突變脂肪酶活性組分proRCL。

1.2.7 突變脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)研究

利用pNPP法對(duì)純化后的突變脂肪酶進(jìn)行酶活測(cè)定[16]。在40 ℃，pH 8.5條件下，每分鐘產(chǎn)生 1 μmol對(duì)硝基苯酚的酶量定義為一個(gè)脂肪酶水解酶活國(guó)際單位 (U)。

利用pNPP法測(cè)定純化后的突變脂肪酶的最適pH及pH穩(wěn)定性，最適溫度和溫度穩(wěn)定性及60 ℃下的半衰期。60 ℃下的半衰期測(cè)定方法為：10 U純化酶于60 ℃下，經(jīng)不同的時(shí)間間隔取出，冰浴20 min，室溫平衡5 min，測(cè)定酶活。取出后酶活為未熱處理時(shí)的 50%的時(shí)間，即為酶在60 ℃下的半衰期t1/2。T50值是在某溫度下放置一定時(shí)間后，使酶活降為原來(lái)的 50%的溫度[17]。測(cè)定方法為：10 U純化酶于40 ～80 ℃℃的范圍中各溫度下熱處理30 min，冰浴20 min，室溫平衡5 min后于40 ℃下測(cè)定酶活。當(dāng)酶活為原來(lái)的50%時(shí)，該熱處理溫度即為酶的T50值。

以 pNPP作為底物測(cè)定純化后的突變脂肪酶的Km值和Kcat值，Km值的測(cè)定采用雙倒數(shù)作圖法。測(cè)定過(guò)程中，底物濃度范圍是25～1 000 mmol/L。

1.2.8 突變脂肪酶三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬和熱穩(wěn)定性機(jī)理研究

利用同源建模法 (SWISS-MODEL)對(duì)出發(fā)脂肪酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模，同源搜索比對(duì)發(fā)現(xiàn)其三級(jí)結(jié)構(gòu)與來(lái)自 Rhizopus niveus的脂肪酶(Protein Data Bank PDB登錄號(hào)1LGY)結(jié)構(gòu)同源性最高，為80.76%，以1LGY為模板酶進(jìn)行同源建模。利用蛋白質(zhì)模型對(duì)熱穩(wěn)定性機(jī)理進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 易錯(cuò)PCR條件優(yōu)化

在易錯(cuò)PCR中，較高濃度的Mg2+可以穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對(duì)，有利于突變。Mn2+可以降低聚合酶對(duì)模板的特異性。為了得到合適的突變率和較高的突變庫(kù)容量，將Mg2+濃度和Mn2+濃度進(jìn)行組合優(yōu)化 (圖1)。將各梯度得到的突變文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，梯度1 (Mg2+7 mmol/L、Mn2+0.1 mmol/L)的平均突變率為0.4%，即每個(gè)基因序列平均有 4個(gè)堿基突變；梯度 2 (Mg2+9 mmol/L、Mn2+0.2 mmol/L)的平均突變率為0.6%，即每個(gè)基因序列平均有6個(gè)堿基突變。梯度3和梯度4的突變率也較高，棄用。同時(shí)，將各梯度得到的突變子接種至BMMYA’平板上，甲醇誘導(dǎo)4 d，用fast-blue RR染色法染色，確定各梯度平板重組畢赤酵母的表達(dá)情況。Fast-blue RR染色結(jié)果顯示，梯度1中，黑色的菌落占總菌落數(shù)的80%；梯度2中，黑色的菌落占總數(shù)的65%；梯度 3和 4中，黑色的菌落占總數(shù)的＜30%，棄用。

綜上，梯度 1，即 Mg2+7 mmol/L、Mn2+0.1 mmol/L時(shí)突變率 (0.25%)較為可行。

2.2 表達(dá)載體pPIK9K的PCR擴(kuò)增

以質(zhì)粒 pPIC9K為模板，9K-longF/R和9K-shortF/R為引物，分別擴(kuò)增得到兩段大小分別為7 226 bp和2 000 bp的片段 (圖1)。

2.3 突變文庫(kù)中突變子熱穩(wěn)定性和酶活的關(guān)系

本研究對(duì)突變文庫(kù)中突變子熱穩(wěn)定性和酶活的關(guān)系進(jìn)行研究。在突變文庫(kù)中隨機(jī)抽取2 000個(gè)突變子檢測(cè)其酶活和熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2。進(jìn)化后，2.5%的突變子的酶活高于出發(fā)菌株，97%的突變子保留出發(fā)菌株 70%以上的酶活，只有少于0.25%的突變子在突變后酶活喪失嚴(yán)重。對(duì)以上隨機(jī)抽取的2 000株突變體進(jìn)行熱穩(wěn)定性初步篩選。利用96孔板發(fā)酵，得到2 000株突變體的粗酶。用pNPP法對(duì)粗酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性篩選。結(jié)果如圖2B：約0.3%的突變酶在熱處理后仍可以保持95%以上酶活，約1%的突變酶熱處理后能保持90%以上酶活，約2.5%的突變酶熱處理后能保持80%以上酶活。考察熱處理后酶活保持在80%以上的46株突變株，0.05%的突變子的酶活和熱穩(wěn)定性都得到了顯著提高，6.25%的突變子熱穩(wěn)定性提高，酶活保留出發(fā)菌株的80%以上。剩余的菌株都是負(fù)突變。以上結(jié)果表明，熱穩(wěn)定性的提高對(duì)酶活影響不大。

圖1 表達(dá)載體pPIC9K長(zhǎng)短片段的擴(kuò)增圖Fig. 1 Amplification of pPIC9K-long and pPIC9K-short. M1: E10 000 DNA Ladder marker; M2: 2 000 bp DNA Ladder marker; 1, 2 : pPIC9K-Short (2 000 bp)and pPIC9K-long (7 226 bp).

圖2 定向進(jìn)化構(gòu)建的突變文庫(kù)總覽圖Fig. 2 The landscape of mutant library. Dash dot line:enzymatic activity of clones in mutant library, plotted in descending order. The solid line: thermostability of clones in mutant library, plotted in descending order.Details in dotted line box in (A)were magnified in (B).For Figure (A), 2 000 clones were randomly selected from the mutant library of first generation, and their enzymatic activities were determined by 96 MTPs screening using pNPP. The enzymatic activity value of each mutant was compared to that of r27RCL, and the ratio was remarked as Y axis of dash dot line. Then, these mutant enzymes were heat-treated at 60 ℃ for 20 min,cooled in ice-bath for 20 min and in room temperature for 5 min. Their residual enzymatic activities were also measured by 96 MTPs screening using pNPP. Then,residual activity value of each mutant was compared to that of its initial activity, and the ratio was remarked as Y axis of solid line.

2.4 熱穩(wěn)定性突變株的初篩與復(fù)篩結(jié)果

實(shí)驗(yàn)共經(jīng)過(guò)2輪易錯(cuò)PCR，突變文庫(kù)容量均約為5 000株突變株左右。每輪篩選得到的突變株及其包含的氨基酸突變位點(diǎn)如下表。

以Fast-blue RR頂層瓊脂顯色進(jìn)行初篩，第一輪得到目的突變體2個(gè)，共包含3個(gè)突變位點(diǎn)(S234F，P168L，V329A)；第二輪得到目的突變體4個(gè)，共包含8個(gè)突變位點(diǎn)，其中有6個(gè)由第二輪易錯(cuò)PCR新引入(D182Y，A230F，A129S，K219D，N366D，L180H)。

2.5 突變脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 突變酶的分離純化結(jié)果

對(duì)各突變酶進(jìn)行純化，純化結(jié)果如圖 3 (以ep2-4的純化蛋白質(zhì)電泳圖為例)。純酶的蛋白質(zhì)分子量大小為37 kDa。

2.5.2 突變酶的最適pH、pH穩(wěn)定性和最適溫度

利用pNPP法對(duì)突變酶的最適pH、pH穩(wěn)定性和最適溫度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，相對(duì)原始酶r27RCL，各突變酶的最適pH、pH穩(wěn)定性和最適溫度幾乎都未發(fā)生變化。

表2 易錯(cuò)PCR得到的突變株及其氨基酸突變位點(diǎn)Table 2 Lineage of variants and amino acid substitutions by error-prone PCR

圖3 突變酶ep2-4的純化結(jié)果Fig. 3 SDS-PAGE analysis of purified mutant ep2-4. 1:culture supernatants; 2: treated with 10 kDa membrane;3: treated with SP-Sepharose chromatography; 4: treated with Phenyl-Sepharose FF chromatography; M: protein ladder.

2.5.3 突變酶的熱穩(wěn)定性

測(cè)定以上各輪突變酶在60 ℃下的半衰期t1/2和各突變酶的T50值。

2.5.4 突變酶ep2-4在60 ℃下的熱穩(wěn)定性及溫度對(duì)Ep2-4的影響

考察原始酶r27RCL和最優(yōu)突變酶ep2-4的熱穩(wěn)定性及溫度對(duì)Ep2-4的影響。

如上圖所示，將純化后的原始酶r27RCL和最優(yōu)突變酶 ep2-4于 20～80 ℃溫度范圍內(nèi)處理30 min后，測(cè)定其殘余酶活。r27RCL在45 ℃下放置 30 min后，酶活喪失 50%；50 ℃下放置30 min后，酶活僅存 20%。而突變酶 ep2-4于55 ℃下放置30 min后，酶活可保存53%；60 ℃下放置30 min后，還殘存30%的酶活。

將純化后的原始酶 r27RCL和最優(yōu)突變酶ep2-4于 60 ℃下處理不同時(shí)間，如上圖所示，r27RCL在4 min內(nèi)喪失50%的酶活，10 min后喪失全部酶活。而突變酶Ep2-4在60 ℃下處理21 min還保留50%的酶活，處理50 min后才喪失全部酶活。在高溫下，Ep2-4的穩(wěn)定性有了顯著提高。

表3 原始酶和各輪突變酶在60 ℃下的半衰期及T50Table 3 Half-lives (60 ℃)and T50 of variants of each generation compared with that of r27RCL

圖4 溫度對(duì)r27RCL和Ep2-4穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effect of temperature on the stability of r27RCL and Ep2-4. Enzymes were incubated for 30 min at the increasing temperatures, after which residual activities were determined taking pNPP as substrate. The error bars show standard deviations calculated for three replicate experiments.

圖5 r27RCL和ep2-4在60 ℃下的熱穩(wěn)定性Fig. 5 Thermostability of the r27RCL and Ep2-4 at 60 ℃. Enzymes were heated at 60 ℃ for increasing times, after which residual activites were determined taking pNPP as substrate. The error bars show standard deviations calculated for three replicate experiments.

表4 原始酶r27RCL和突變酶ep2-4的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic parameters of the parent and ep2-4

2.5.5 酶動(dòng)力學(xué)分析

考察原始酶r27RCL和突變酶ep2-4的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

以 pNPP為底物檢測(cè)測(cè)定 r27RCL和 ep2-4的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。如上表，突變酶Ep2-4對(duì)于底物的親和性比r27RCL下降了3.6%，轉(zhuǎn)化數(shù)上升了 2.6%，總體的轉(zhuǎn)化效率幾乎保持不變，即突變酶的酶活沒(méi)有受到影響。

2.6 突變脂肪酶的結(jié)構(gòu)模擬與突變位點(diǎn)分析

眾所周知，單個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)酶熱穩(wěn)定性提高的作用難以精確解釋，因?yàn)榭梢酝瑫r(shí)影響酶熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)因素較多，單個(gè)因素的影響又很微小，而它們的綜合影響卻很巨大。目前，r27RCL的晶體結(jié)構(gòu)還沒(méi)有報(bào)道，以與其具有較高同源性的 R. niveus的脂肪酶的結(jié)構(gòu)為模板，對(duì)原始酶r27RCL的結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，研究突變位點(diǎn)對(duì)酶熱穩(wěn)定性可能產(chǎn)生的影響。

對(duì)突變脂肪酶Ep2-4的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，如圖6，3個(gè)氨基酸突變位點(diǎn) (A129S、P168L和V329A)顯示為紅色，其中A129S和P168L位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面，遠(yuǎn)離酶的催化中心(S265-D324-H377)。眾所周知，蛋白質(zhì)熱變性最初都是從蛋白質(zhì)表面的部分開始的[18-19]。V329A在蛋白質(zhì)內(nèi)部，與活性中心接近。

突變 A129S位于蛋白質(zhì)表面一個(gè) α螺旋的尾端，該突變可能是通過(guò)增加蛋白質(zhì)的親水性和極性來(lái)提高酶的熱穩(wěn)定性[20]。另一個(gè)推測(cè)是突變后的 Ser129可能會(huì)與 Gln136中的氨基形成氫鍵，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)表面的穩(wěn)定性[21-22]。突變前，Ala129和Gln133在空間上沒(méi)有重疊區(qū)域；突變后，Ser129和Gln133在空間上出現(xiàn)重疊區(qū)域，且Ser129帶有的羥基中的氧與Gln133帶有的酰胺基中的氫原子間距離為3.08 ? (圖7)，可以形成強(qiáng)度中等的氫鍵。

突變P168L位于蛋白質(zhì)表面連接α螺旋和β轉(zhuǎn)角的 loop上，由 Pro突變成了疏水性更強(qiáng)的Leu (圖8)。突變前，Pro168和鄰近的α螺旋上Leu164在空間上沒(méi)有重疊區(qū)域 (圖8A)，而突變后，Leu168和Leu164在空間上出現(xiàn)重疊區(qū)域，推測(cè)Leu168和Leu164形成疏水鍵，從而增加了脂肪酶表面的疏水性，提高了酶的熱穩(wěn)定性[23-24]。

突變 V329A位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，與活性中心接近。Val突變?yōu)锳la，會(huì)使蛋白質(zhì)疏水性降低，可能會(huì)影響酶活。但是酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明，該突變對(duì)酶活幾乎沒(méi)有產(chǎn)生影響。目前尚不了解該突變位點(diǎn)對(duì)熱穩(wěn)定性的影響，還需要進(jìn)一步的研究才能得出結(jié)論。

以上的位點(diǎn)對(duì)熱穩(wěn)定性所起的作用均為推測(cè)分析，需要后續(xù)的研究來(lái)確定分析的準(zhǔn)確性。

圖6 突變?nèi)A根霉脂肪酶Ep2-4的三維結(jié)構(gòu)模擬Fig. 6 Simulted three-dimensional structure of mutant Rhizopus chinensis lipase Ep2-4. The three amino acid substitutions (A129S, P168L, V329A)in Ep2-4 were shown in red sticks and the catalytic residues were shown in blue sticks (in the oval).

圖7 位點(diǎn)129突變前 (A)后 (B)三維結(jié)構(gòu)模擬Fig. 7 Simulated three-dimensional structure prior (A)and after (B)residue 129 muation. The red part was residue Ala129 (A)and Ser129 (B), the blue part was the nearby Gln133, formng hydrogen bond with Ser129.

圖8 位點(diǎn)168突變前 (A)后 (B)三維結(jié)構(gòu)模擬Fig. 8 Simulated three-dimensional structure prior (A)and after (B)residue 168 muation. The red part was residue Pro168 (A)and Leu168 (B), the blue part was the nearby Leu164, formng hydrophobic bond with Leu168.

3 討論

易錯(cuò)PCR通過(guò)控制Mg2+、Mn2+和dNTP濃度來(lái)控制突變率。一般來(lái)說(shuō)，控制合適的突變率為 0.5%～2%[25]之間。這樣可以保證在獲得有效突變子的同時(shí)，保證酶其他方面的能力。有報(bào)道表明，酶熱穩(wěn)定性提高通常要以損失酶活為代價(jià)[26-27]。但是本文通過(guò)對(duì)整個(gè)突變庫(kù)中突變子酶活和熱穩(wěn)定性關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，97%的突變子可以保持70%以上的酶活，可以篩選到熱穩(wěn)定性大幅提高、仍保持原有催化水平的突變株。

本文經(jīng)過(guò)2輪易錯(cuò)PCR，獲得了60 ℃下半衰期提高2.5倍的突變株，此突變株包含3個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)。為了考察這3個(gè)突變位點(diǎn)單獨(dú)作用時(shí)對(duì)熱穩(wěn)定的影響，及其組合后是加和還是協(xié)同作用，需構(gòu)建這3個(gè)突變位點(diǎn)的單突變體和雙突變體，才能精確分析各突變位點(diǎn)的作用。在此基礎(chǔ)上，再利用DNA shuffling或理性設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)一步提高酶的熱穩(wěn)定性。

另外，可以將突變酶進(jìn)行純化結(jié)晶，利用X-ray來(lái)進(jìn)行酶結(jié)構(gòu)分析和模擬。由此可以較為準(zhǔn)確地分析出各突變位點(diǎn)對(duì)熱穩(wěn)定性的影響，為進(jìn)一步改造酶的性質(zhì)提供理論依據(jù)。

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