王彥鳳，吳曼琳，王曉晶，王婧，李洋，連夢瑤，王志鋼

1 內蒙古大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010021

2 赤峰市醫(yī)院，內蒙古 赤峰 024000

胞外信號調節(jié)激酶 (Extracellular regulated protein，Erk)是絲裂原激活蛋白激酶 (Mitogen activated protein kinase，MAPK)家族中的一個亞族，是Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的重要成分，該信號通路介導著多種生物學效應，如細胞的增殖、分化，調節(jié)細胞周期[1]。該酶被激活后，成為磷酸化的ERK (p-ERK)，p-ERK可以介導信號由胞漿向胞核傳遞，參與調節(jié)細胞的生長、發(fā)育、分化、分裂等多種生理過程，其異常表達在細胞的惡性轉化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。對erk基因的研究不僅可以區(qū)別物種間的遺傳差異和進化特征，而且對動物細胞生長及個體發(fā)育過程中對外界影響因素的反應機制研究具有重要意義。早在 1990年，Boulton等發(fā)現了一種與酵母KSS1和FUS3激酶有著驚人相似的酶，被稱為ERK1[3]。1991年，Boulton等繼而發(fā)現了一類 ERK酶類，定義為ERK1、ERK2和ERK3等。ERK1和ERK2基因有90%的同源性，相對分子量分別為44 kDa和42 kDa[4]。Srinivasan等發(fā)現在鼠類血管發(fā)生中，Ras介導的信號通路是內皮細胞增殖和遷移的必要條件，缺乏ERK1/2會抑制初期內皮細胞的增殖[5]。Miltenberger等應用反義c-Raf1或抑制性Raf1使NIH3T3細胞的增殖受到干擾，而組成性激活的Raf1能加速增殖過程[6]。在許多腫瘤細胞中，都能檢測到ERK信號通路的異?；罨珺oucher等研究表明胰腺癌組織中的 ERK活性是癌組織周圍正常組織的 2～18倍。Kang等研究表明，白血病細胞K562凋亡特性與ERK基礎活性較高有關[7]。ERK通路與細胞周期的調控有著緊密的聯(lián)系。有資料顯示，ERK信號通路是多數生長因子、細胞因子調控靶細胞增殖的重要途徑[8]。運用MEK抑制劑U0126阻斷ERK通路，會抑制細胞周期蛋白D1 (CyclinD1)表達[9]。使用MEK抑制劑PD98059處理HT1080細胞，24 h后細胞仍然停留在G2/M期，使細胞周期阻滯[10]。內蒙古白絨山羊是經過長期自然選育形成的優(yōu)良地方性絨肉兼用型品種，對營養(yǎng)的需求、利用與代謝有其特殊性。erk基因及其編碼的蛋白已在一些動物中得到深入研究，但尚未有山羊erk基因研究方面的報道。建立有效地克隆內蒙古白絨山羊 erk2基因的 RT-PCR體系及定量RT-PCR體系，獲得erk2基因編碼區(qū) cDNA序列及該基因的基本表達模式，為進一步研究該基因產物在機體發(fā)育中的作用提供條件。

1 材料與方法

1.1 相關載體及試劑

克隆載體 pMD19-T Vector、LA-Taq DNA polymerase、T4 DNA 連接酶以及 10×T4 DNA連接酶緩沖液、常用限制性內切酶及緩沖液、DNA分子量標準 DL2000、氨芐青霉素、卡那霉素、X-gal、IPTG、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 (50次量)、RNAiso試劑盒 (TaKaRa，Cat. No. 3124)等均購自寶生物工程 (大連)有限公司 (TaKaRa)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 (DP209-02離心柱型)購自TIANGEN BIOTECH (BEIJING)CO., LTD.；其余試劑為國產分析純。

1.2 動物組織及細胞培養(yǎng)

內蒙古白絨山羊40 d的胎兒采自內蒙古白絨山羊種羊場，帶回實驗室后經原代培養(yǎng)純化胎兒成纖維細胞，于液氮中保存。繼代培養(yǎng)采用單層培養(yǎng)子代細胞，實驗使用P1至P4代次之間的胎兒成纖維細胞。所用培養(yǎng)基為含有 10%FBS的 DMEM/F12，培養(yǎng)條件為 37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件。

脾、睪丸、腦、肝、肺、乳腺和腎等組織樣本取自新屠宰羊，迅速放入-196 ℃的液氮中冷凍后并置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA的提取及反轉錄

按總 RNA提取試劑盒 (RNAiso Reagent)說明書的操作方法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的完整性，經紫外線測定定量后，用Oligod(T)18-Primers按照反轉錄酶AMV說明書的方法反轉錄合成第一鏈cDNA (cDNA1)，作為下一步PCR擴增編碼區(qū)片段的模板。

1.4 內蒙古白絨山羊erk2基因的分子克隆

從GenBank中查找出與絨山羊親緣關系較近的牛、馬、小鼠、大鼠、人等物種的erk2基因的CDS區(qū)序列，并進行同源比對。根據erk2基因的CDS區(qū)序列設計引物P1 (表1)，其中包含的酶切位點為SacⅠ、NdeⅠ (上游)，XhoⅠ、PstⅠ (下游)。預計擴增片段長度1 083 bp，以絨山羊胎兒成纖維細胞cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件為：94 30 s℃，58 30 s℃，72 ℃16 s，30個循環(huán)。

擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，回收特異性條帶，將其克隆到pMD19-T載體，轉化E. coli DH5α。藍、白菌落篩選陽性克隆，重組質粒經PCR與酶切鑒定正確后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.5 生物信息學方法

基因cDNA序列用NCBI上的BLAST進行序列比對 (http：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，開放閱讀框 (ORF)預測采用 ORF Finder軟件(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，蛋白質結構域分析采用SMART程序 (http://smart.embl.de/)，蛋白質功能位點分析采用 Psite程序 (http://www.softberry.com)，蛋白質亞細胞定位采用 PSORT程序 (http://psort.nibb.ac.jp)，蛋白質等電點及分子量預測采用在線軟件 (http://isoelectric.ovh.org/)分析，用 MEGA4.1軟件進行同源性比對及構建進化樹，利用瑞士模型工作區(qū)(Swiss-Model workspace)預測蛋白質二級結構(http:// swissmodel.expasy.org/)。

1.6 定量RT-PCR檢測組織表達特異性

1.7 利用免疫組化方法檢測組織表達特異性

收集內蒙古白絨山羊睪丸組織材料，按下列步驟處理：4%的多聚醛固定，酒精脫水，包埋，切片，酒精脫蠟，免疫動物血清封閉，一抗 (Rabbit anti-ERK2)4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，生物素標記的二抗室溫孵育 10 min，PBS洗 3次，依據試劑盒的說明利用 DAB(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)染色，顯微鏡觀察，照相，每種組織設一個負對照。

2 結果與分析

2.1 erk2基因克隆與序列分析

絨山羊erk2基因PCR擴增產物經電泳檢測分析，在預期的1 083 bp處有特異性擴增條帶 (圖1)。重組質粒經PCR和酶切雙重鑒定正確。序列測定結果表明，擴增出的CDS全長1 083 bp，編碼360個氨基酸。通過Blast比對，內蒙古白絨山羊erk2基因的核苷酸序列與牛Bos taurus (BC133588.1)、狼 Canis lupus (NM_001110800.1)、人 Homo sapiens (NM_138957.2)、 野 豬 Sus scrofa(NM_001198922.1)、 小 鼠 Mus musculus(NM_011949.3)、 大 鼠 Rattus norvegicus(NM_053842.1)等物種的同源性分別為 96%、96%、92%、92%、89%和 89%，相應的氨基酸序列同源性均達到 96%以上，與牛的同源性更達到了 100%。序列提交 GenBank得到序列登記號為 JX569765。使用 MEGA4.1軟件對上述序列進行比對構建進化樹 (圖 2)，從圖中可以發(fā)現，erk2是一個相對保守的基因，在各物種間的差異非常小。

表1 本研究中用到的引物Table 1 Primers used in this study

圖1 erk2基因cDNA全長的PCR擴增Fig. 1 PCR product of erk2 gene. M1: λ-EcoT14 DNA marker; 1: PCR products; 2: negative control; 3: β-actin positive control; M2: DL 2 000 DNA marker.

圖2 各物種erk2核苷酸聚類分析Fig. 2 Alignment of several species of erk2 nucleotide sequence.

2.2 生物信息學分析

erk2基因編碼一個由 360個氨基酸殘基組成的蛋白質，該蛋白理論分子質量41.38 kDa，等電點 (pI)為 6.711，氨基酸組成中亮氨酸含量最高，為11.9%。SMART分析表明，在該蛋白質中 25～313位氨基酸是一個 S_TKc結構域(Serine/threonine kinase catalytic domain)，即絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域 (圖3)。已知的ERK蛋白是典型的絲/蘇氨酸激酶，SMART分析結果進一步表明絨山羊erk2基因被正確克隆。

利用Swiss-Model workspace[12-14]預測蛋白質二級結構 (圖 4)。對其編碼的氨基酸序列進行 Psite分析表明，含 2個 N-糖基化位點、1個依賴于 cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化位點、3個蛋白激酶c磷酸化位點、5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、2個 N-豆蔻?；稽c、2個異戊二烯基結合區(qū) (CAAX box)、7個微體羧基端靶向信號、2個蛋白激酶ATP結合區(qū)標記及一個絲/蘇氨酸蛋白激酶活性區(qū)域標記 (圖5)。PSORT (k-NN prediction)程序預測其定位于細胞質中。

圖3 erk2基因編碼蛋白質SMART分析 (圖中數字為氨基酸編號)Fig. 3 SMART analysis of the protein translated from erk2 gene (The number shows the location of each domain in protein).

圖4 ERK2蛋白的3D圖(9?358氨基酸序列)Fig. 4 Three-dimensional models of certain regions of ERK2 ( amino acid residues 9 to 358).

2.3 組織表達特異性檢測

經定量RT-PCR顯示檢測，erk2基因在內蒙古絨山羊的心臟、脾、腎、肺、皮膚及乳腺組織中均有不同程度的表達。其中心臟、皮膚以及乳腺組織中mRNA豐度較高，脾、腎中的表達相對較低 (圖 6)。利用免疫組化方法檢測ERK2蛋白在睪丸中有特異性的表達 (圖7)。

3 討論

ERK屬于絲裂原激活蛋白激酶 (Mitogen activated protein kinase，MAPK)家族中的一個亞族，包括ERK1與ERK2，后者研究更加深入。人類的 ERK2蛋白包括360個氨基酸殘基，而鼠類包括 358個氨基酸殘基[15]。該家族的蛋白一級結構具有兩個典型的特征：一是TXY三肽基，被稱為“磷酸化唇”或“活化唇”，ERK2的上游信號分子通過識別這一結構來活化ERK2，已報道的ERK2三肽基為“TEY”；另一個是絲氨酸/蘇氨酸激酶催化活性的S_TKc結構域。本試驗所克隆的內蒙古白絨山羊erk2基因ORF推測編碼360個氨基酸殘基，蛋白質經SMART程序分析具有這兩種保守位點，與其他物種的 ERK2蛋白相符，證明內蒙古白絨山羊erk2基因被正確克隆。

Boulton等[2]通過 Northern blotting方法研究erk基因的組織特異性表達情況，發(fā)現其在小鼠的各種組織中均有表達，對于erk2來說，發(fā)現其在肌肉、胎盤以及大腦中的表達量最高。而且利用Western blotting的方法研究得到了相同的結果。本研究利用定量RT-PCR檢測結果表明，erk2基因在內蒙古白絨山羊的心臟、脾、腎、肺、皮膚及乳腺組織中均有不同程度的表達。表明erk2基因可在多種組織中表達，進一步證明該基因在哺乳動物中具有保守的功能。

圖5 內蒙古白絨山羊ERK2氨基酸序列與牛、小鼠及人的氨基酸序列比較及Psite活性位點分析 (1個依賴于cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化位點 (氨基酸序列為KKLS)，以雙波浪線標記；3個蛋白激酶c磷酸化位點 (氨基酸序列為TLR、TAR及SNR)，以灰色底紋標記；5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點 (氨基酸序列為SAYD、SPFE、TLRE、TTCD 及 SQED)，以方框標記；2個蛋白激酶 ATP 結區(qū) (氨基酸序列為IGEGAYGMVCSAydnvnkvrVAIK、IGEGAYGMVCSAydnvnkvrvAIKK)，以點下劃線標記；1個絲/蘇氨酸蛋白激酶活性區(qū)域 (氨基酸序列為 VLHRDLKPSNLLL)，以灰色下劃線標記；2個 N-糖基化位點 (氨基酸序列為NLSY、NTTC)，以波浪線標記)Fig. 5 Alignment of protein ERK2 amino acids sequence between Inner Mongolia Cashmere Goat and Bos taurus,Mus musculus and Homo sapiens. The active sites are searched by Psite. A cAMP/cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site (KKLS)is marked by double wavy line; Three protein kinase C phosphorylation sites(TLR/TAR/SNR)are marked by gray shadow. Five casein kinase phosphorylation sites(SAYD/SPFE/TLRE/TTCD/SQED)are marked by pane. Two protein kinase ATP-binding regions(IGEGAYGMVCSAydnvnkvrVAIK/IGEGAYGMVCSAydnvnkvrvAIKK)are marked by hidden underline; A Ser/Thr protein kinase activity region (VLHRDLKPSNLLL)is marked by gray underline. Two N-glycosylation site(NLSY/NTTC)are marked by wavy line.

圖6 定量RT-PCR檢測內蒙古白絨山羊erk2基因組織表達特異性Fig. 6 Tissue-specific expression of erk2 gene of Inner Mongolia Cashmere Goat by quantitative RT-PCR.

圖7 睪丸中ERK2的表達Fig. 7 Expression of ERK2 protein in testis. (A)Negative control. (B)ERK2 is expressed in brown tissue cells. Scale bars=25 μm.

Ras/Raf/MEK/ERK信號通路可以感應多種信號分子，參與多種細胞進程，與多種疾病發(fā)生密切相關，如：腦損傷[16]、癌癥[17]、肥胖[18]、糖尿病[19]以及炎癥[20-21]等。近年來隨著ERK的深入研究，一些新的功能也被相繼報道。研究發(fā)現，長期的壓力會降低小鼠海馬體以及前額皮質中ERK的表達，而利用氟西汀處理會抵消這種反應[22]，這一新功能的發(fā)現為抗抑郁癥藥物的研發(fā)帶來了新的思路[23]。Zhu等研究發(fā)現，MAPK/ERK信號通路與血清饑餓引起的人成骨細胞凋亡相關[24]。

內蒙古白絨山羊 (Inner Mongolia Cashmere Goat)是經過長期的自然選擇和人工選育而形成的優(yōu)良產絨品種，但近年來由于草場退化，種群數量增加，舍飼比例加大，導致其生產性能降低，這其中機體對營養(yǎng)和能量信號刺激的敏感性起著重要的作用，但機制尚不清楚。多項研究顯示ERK通路在營養(yǎng)攝入與調節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用，如ERK通路可以調節(jié)氨基酸刺激細胞后的信號傳遞過程[25]；動物食料中缺乏必需氨基酸時，會激發(fā)ERK信號通路而不是mTOR信號通路[26]；ERK信號通路可以調節(jié)氨基酸運輸從而調節(jié)細胞的增殖[27]。本研究正確克隆了內蒙古白絨山羊erk2基因并對其基本表達模式進行了分析，這些結果將為進一步研究ERK在絨山羊細胞生長和早期胚胎發(fā)育中的功能及發(fā)揮作用的分子機制提供條件。

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