★ 鄒浪 李曉芳 鄧紅 曹森

(1.江西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 南昌330006;2. 江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330006)

氟尿嘧啶的理化性質(zhì)及透皮促滲劑對氟尿嘧啶經(jīng)皮滲透的研究

★ 鄒浪1李曉芳1鄧紅1曹森2*

(1.江西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 南昌330006;2. 江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330006)

目的：對氟尿嘧啶的理化性質(zhì)進行研究，并考察促滲劑對氟尿嘧啶透皮吸收的影響，為氟尿嘧啶經(jīng)皮給藥劑型的設(shè)計提供理論依據(jù)。方法：考察溫度、光照及pH對氟尿嘧啶穩(wěn)定性的影響；測定氟尿嘧啶在水、不同pH磷酸鹽緩沖液以及多種油和表面活性劑中的溶解度；采取改進的Franz擴散池和離體小鼠皮膚研究氟尿嘧啶在不同pH環(huán)境下以及添加促滲劑后對離體鼠皮透皮吸收的影響。結(jié)果：在4℃、25℃、32℃、60℃條件下，在pH5.0、pH7.4、pH8.0磷酸鹽緩沖液中，在光照條件(4 500 Lx)下，氟尿嘧啶均能穩(wěn)定存在。氟尿嘧啶在水及不同pH磷酸鹽緩沖液中的溶解度均大于在油和表面活性劑中的溶解度。氟尿嘧啶在水和不同pH磷酸鹽緩沖液中的體外經(jīng)皮釋放均符合零級釋放。含不同促滲劑的氟尿嘧啶的透皮速率及累積滲透量有明顯差別，其促進強度依次為桉葉油>薄荷油>氮酮>H二乙二醇單乙基醚H>N-甲基-2-吡咯烷酮。結(jié)論：氟尿嘧啶不受溫度、光照、pH值的影響；制成經(jīng)皮給藥制劑時，桉葉油的加入對氟尿嘧啶的促滲作用最大。

氟尿嘧啶；穩(wěn)定性；溶解度；促滲劑；透皮作用

5-氟尿嘧啶(5-Fu)是一種具有抗癌活性的抗代謝藥物，局部應(yīng)用時依靠其細(xì)胞毒性，對增殖細(xì)胞進行有效殺滅，可用于治療光角質(zhì)化病、鱗狀細(xì)胞癌、淺表基底細(xì)胞癌等多種皮膚癌和尖銳濕疣、白癜風(fēng)、銀屑病等一系列頑固性皮膚病。[1]但5-Fu極性大，脂溶性差，難以通過皮膚角質(zhì)層到達癌變區(qū)域，使其治療作用受到很大限制。研究者們采取多種方法以增強其透過能力，如離子電滲療法[2]、激光處理[3]、前體藥物[4]和添加促透劑[5-6]等。

微乳是由表面活性劑、助表面活性劑、油相和水組成的澄清、穩(wěn)定和各向同性的熱力學(xué)穩(wěn)定分散體系。[7]研究表明，W/O型微乳因為具有增加親水性、難滲透藥物與角質(zhì)層的相容性、改變脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)、較小粒徑及易透過皮膚毛囊孔[8]等性質(zhì)，成為可能解決親水性藥物經(jīng)皮滲透問題的一個新途徑。經(jīng)前期研究制備了5-Fu W/O型微乳，體外透皮實驗結(jié)果表明，12h累積透過量分別為0.5%5-Fu水溶液和2.5%市售乳膏(O/W型)的19.1倍和7倍，可見W/O型微乳的確促進了5-Fu的皮膚透過能力。[8]因此，選擇合適的經(jīng)皮給藥劑型能顯著的改善藥物的透皮效果。本文對5-Fu進行了處方前研究，測定了5-Fu在水、不同pH緩沖鹽溶液以及多種油和表面活性劑中的溶解度，考察了5-Fu溶液的穩(wěn)定性，對不同pH環(huán)境以及添加一系列促滲劑后5-Fu的經(jīng)皮滲透進行了研究和探討，獲得5-Fu皮膚吸收及經(jīng)皮滲透規(guī)律，為5-Fu經(jīng)皮吸收制劑研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑

氟尿嘧啶(5-Fu，純度98%，山東臨邑氟瑞精細(xì)化工有限公司)；2.5%氟尿嘧啶乳膏(廣東順峰藥業(yè)有限公司)；磺化琥珀酸二辛酯鈉(AOT，北京百靈威公司)；吐溫80(Tween80)、吐溫85(Tween85)、吐溫20(Tween20)、丙二醇(PG)(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；司盤80(Span80)、乙醇(Ethanol)、聚乙二醇400(PEG400)、油酸乙酯(Ethyl oleate)(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；油酸(OA，淄博豐森油脂化工有限公司)；丙三醇(Glycerol，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司)；桉葉油(Eucalyptus，鄭州錦德化工有限公司)；薄荷油(Peppermint，鄭州浩力化工有限公司)；肉豆蔻酸異丙酯(IPM)、棕櫚酸異丙酯(IPP)(英國Croda公司)；聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯(CremorpH EL，德國BASF公司)；亞油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil 2125CS)、辛酸/癸酸三甘油酯(GTCC)、丙二醇月桂酸酯(HLauroglycolTMFCCH)、丙二醇辛酸酯(HCapryolTMPGMCH)、丙二醇單辛酸酯(HCapryolTM90H)、聚甘油酸酯(HPlurol?oleique CC 497H)、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol?)、單亞油酸甘油脂(Maisine35-1)、中鏈甘油三酯(HLabrafacTMWL 1349H)、二乙二醇單乙醚(Transcutol P)(法國Gattefosse公司)；聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯(Solutol?HS 15，德國BASF有限公司)；辛癸酸甘油酯(ODO，浙江千島精細(xì)化工廠)；氮酮(Azone，廣州助劑化工廠)；N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP，上海ISP有限公司)；甲醇(色譜純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(LC-10AT VP，SPD-10A VP紫外-可見檢測器,日本島津公司)；透皮擴散試驗儀及改進的擴散池(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司)。

1.3 動物

昆明種小鼠(♂，體質(zhì)量18-22g，江西中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。動物合格證號:2011-0188)。

2 方法

2.1 含量測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil ODS C18(4.6mm×250mm,5μm)；流動相：甲醇-水(90∶10,v/v)；流速：1.0mL/min；檢測波長：266nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取5-Fu適量,用流動相配成濃度為1.0mg/mL的貯備液，然后用流動相分別稀釋成1、10、30、50和80μg/mL的系列對照品溶液,在上述色譜條件下各取20μL進樣。

2.1.3 樣品溶液的配制 精密量取含5-Fu的溶液0.1mL于10mL量瓶中，加5mL甲醇，超聲10min，用流動相稀釋至刻度，進樣20μL，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算藥物含量。

2.2 5-Fu溶液的穩(wěn)定性研究

2.2.1 溫度及光照對5-Fu穩(wěn)定性的影響 用去離子水配制濃度為5mg/mL的5-Fu溶液于具塞管中，分別保持4℃、25℃、32℃、60℃恒溫或置于光照條件(4500 Lx)下，于第0、5、10d取樣。

2.2.2 不同pH緩沖液對5-Fu穩(wěn)定性的影響 分別用pH5.0、pH7.4、pH8.0磷酸鹽緩沖液配制濃度為5 mg/mL的5-Fu溶液于具塞管中，室溫放置，于第0、5、10d取樣。

2.3 5-Fu在不同載體中溶解度的測定

分別量取5 mL去離子水、各種緩沖液、油及表面活性劑于10 mL具塞管中，分別加入500 mg 5-Fu，渦旋3min，于25℃搖床振蕩72h，12 000r/min離心15min，取上清液用0.45μm微孔濾膜保溫過濾，用甲醇稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，取20μL進樣。

2.4 小鼠離體皮膚的體外經(jīng)皮滲透實驗

將小鼠斷頸處死后，剃除其腹部毛發(fā)，剪下腹部皮膚，除去皮下脂肪，用生理鹽水沖洗皮膚內(nèi)表面。將皮膚固定在擴散池的上、下兩室之間，角質(zhì)層朝上，接受液為0.9%的生理鹽水溶液(接受池體積為17.2mL，透過面積為2.83cm2)，釋放液為藥液1mL(濃度均為5mg/mL)。將裝置置于(32±0.5)℃恒溫水浴中，開動攪拌(300r/min)，分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12h取樣2mL，同時補加相同溫度等體積新鮮接受液。樣品過0.22μm微孔濾膜，取樣品續(xù)濾液1mL用HPLC測定藥物濃度，計算藥物的單位面積累積透過量(Qn)。對各組累積透過量進行獨立t檢驗。

以Qn和經(jīng)皮滲透速率(Jss)為指標(biāo)，進一步篩選促滲劑。給藥池中是含藥溶液,接受池中溶液能溶解藥物的量遠(yuǎn)大于藥物的飽和溶解度，滿足漏槽條件，可用下式計算Qn:

用下式計算藥物經(jīng)皮滲透速率：

1-1式中：Cn為第n個取樣點濃度(μg/mL)，Ci為第i個取樣點濃度(μg/mL)，Vo為接收池的體積(mL)，V為每次取樣的體積(mL)，A是本擴散裝置的擴散面積，為2.83cm2。以Qn(μg/cm2)對t(h)作圖，所得曲線斜率即為Jss(μg/(cm2·h))。

2.5 促滲劑的加入方法

促滲劑的加入方法有直接加入樣品溶液法[9]以及皮膚預(yù)處理法，[10]本文采取直接加入法，將一定含量的促滲劑直接加入到樣品溶液中，室溫下攪拌30min，使其混合均勻。本文分別選擇氮酮(3%，w/w)，桉葉油(2%,w/w)，薄荷油(2%,w/w)，N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP,5%,w/w)，TranscutolP(5%,w/w)為促滲劑進行考察。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

A.空白；B.對照品；C.樣品

由圖1可知，5-Fu的保留時間為5.3min左右，在本實驗條件下其他成分對藥物測定沒有干擾。以峰面積A對質(zhì)量濃度C(μg/mL)線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=60793C+143.4(r=1)，線性范圍1-80μg/mL，方法回收率為102.4%，日間、日內(nèi)RSD(%)分別為0.3和0.4，結(jié)果表明該分析測定方法準(zhǔn)確、可靠，滿足含量測定要求。

3.2 溫度、光照和pH對5-Fu穩(wěn)定性的影響

表1 溫度、光照和pH對5-Fu穩(wěn)定性的影響

溫度、光照和pH對5-Fu穩(wěn)定性的影響結(jié)果見表1。結(jié)果表明5-Fu溶液在4℃、25℃、32℃、60℃下，在pH5.0、pH7.4、pH8.0磷酸鹽緩沖液中，在光照條件下放置10d，藥物含量基本沒有發(fā)生變化，表明含有5-Fu的制劑制備時不需要考慮溶液溫度、pH及光照的影響。

3.3 去離子水以及不同pH值緩沖液中5-Fu的溶解度

5-Fu在去離子水以及pH5.0、pH7.4、pH8.0的磷酸鹽緩沖液中的溶解度見表2。結(jié)果表明，5-Fu在不同pH條件下溶解度不同。在pH 5.0～pH 8.0范圍內(nèi)，5-Fu隨溶液pH的增大溶解度增大。這與5-Fu是一個二元弱酸結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，據(jù)文獻報道[9]，5-Fu的PKa1=8，PKa2=13，pH越高其離子型所占比例越大，隨之溶解度也越大。

表2 5-Fu在水和不同pH值緩沖液中的溶解度

3.4 不同油中5-Fu的溶解度

5-Fu在一系列油中的溶解度見表3。5-Fu由于極性較大，在油中溶解度均較小。比較而言，5-Fu在Masine35-1中的溶解度最大，Labrafil 2125CS次之，而在具有透皮促進作用并與皮膚相容性較好的油相IPM、IPP里溶解度卻非常低。

表3 25℃ 5-Fu在不同油中的溶解度

3.5 不同表面活性和助表面活性劑中5-Fu的溶解度

由表4可知，表面活性劑和助表面活性劑對親水性藥物5-Fu增溶作用較小，其溶解度均小于藥物在水中的溶解度(12.10±0.16mg/mL)。相比較而言，表面活性劑中，藥物在Solutol?HS 15中溶解度最大，在Tween85中次之。藥物在助表面活性劑中的溶解度以在PG中最大，Transcutol P次之。由表2、3、4的結(jié)果可知，氟尿嘧啶在水及不同pH磷酸鹽緩沖液中的溶解度均大于在油和表面活性劑中的溶解度，適合制成W/O型微乳。

表4 25℃ 5-Fu在不同表面活性劑和助表面活性劑中的溶解度

3.6 5-Fu在去離子水和不同pH緩沖液中的體外經(jīng)皮滲透

5-Fu在去離子水和不同pH的緩沖液中的經(jīng)皮滲透結(jié)果見圖2和表5。5-Fu水溶液和緩沖溶液的體外經(jīng)皮釋放均符合零級釋放。在去離子水和pH 7.4緩沖液中的累積滲透量經(jīng)獨立t檢驗沒有顯著性差別，均大于5-Fu在pH 5.0和pH 8.0緩沖液中的累積滲透量，這個結(jié)果與Brahma N. Singh[6]報道的結(jié)果相一致：5-Fu是一個二元弱酸，當(dāng)pH在5～8之間變化時其分子型在溶液中所占的比例在不斷的減少，但對于5-Fu這類親水性藥物來說，其離子型和分子型均能夠通過一定方式透過皮膚(離子型藥物可能可以通過細(xì)胞旁路進行滲透)。在溶液pH達到7.4時，藥物在溶液中分子型和離子型可能達到最佳滲透比例，累積滲透量最大。因此，制備5-Fu的透皮制劑除了使用去離子水做溶劑外，也可以考慮pH 7.4磷酸鹽緩沖液做溶劑。

-■-pH5.0-◆-pH7.4-▲-pH8.0-◇-去離子水

表5 5-Fu水溶液及不同pH緩沖鹽溶液的經(jīng)皮滲透量和經(jīng)皮滲透速率±s,n=6)

3.7 不同促滲劑對5-Fu經(jīng)皮滲透的影響

表6 含有不同促進劑的5-Fu水溶液的經(jīng)皮滲透量和經(jīng)皮滲透速率±s,n=6)

目前促進藥物經(jīng)皮滲透的方法有很多種，但化學(xué)促滲劑仍占有很重要的位置。文獻報道促滲劑Azone(3%，w/w)，[6,9]桉葉油(2%,w/w)，薄荷油(2%,w/w)，[11]NMP(5%,w/w)，[12]Transcutol P(5%,w/w)對5-Fu或其它親水性藥物經(jīng)皮滲透有著較好的促滲作用，因此，本實驗分別考察了上述物質(zhì)對5-Fu體外經(jīng)皮滲透行為的影響，并與未加促滲劑的5-Fu水溶液的滲透行為做比較，結(jié)果見表6。

與對照組相比，在含藥水溶液中加入了3%Azone，5%NMP，2%桉葉油，2%薄荷油，5%Transcutol P之后，5-Fu的12h累積經(jīng)皮滲透量分別提高了1.9，1.49、3.57、2.2、1.7倍。可見，桉葉油對5-Fu的促滲作用最大。桉葉油[12]是一類具有芳香氣味的萜烯類物質(zhì)，它可以通過提高脂質(zhì)雙分子層的流動性來增加藥物的擴散系數(shù)，增加藥物從基質(zhì)向角質(zhì)層的分配，并能刺激皮下毛細(xì)血管的血液循環(huán)，所以具有較強的促滲作用。因此，在5-Fu經(jīng)皮給藥制劑中可以考慮加入桉葉油作為促滲劑。

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征稿啟事

《江西中醫(yī)藥》所設(shè)的重點欄目有《明醫(yī)心鑒》、《滕王閣醫(yī)話》等。《明醫(yī)心鑒》以介紹名老中醫(yī)經(jīng)驗和中醫(yī)臨證心得為主，重點刊載中醫(yī)關(guān)于疑難病的診療經(jīng)驗，要求觀點、方法新，經(jīng)驗獨到?！峨蹰w醫(yī)話》主要反映中醫(yī)教學(xué)、科研、臨床的一得之見，要求以小見大，有感而文，語言生動流暢，可讀性強，富于知識性、趣味性。

StudyonPhysicochemicalPropertiesofFluorouracilandPercutaneousEffectofTransdermalEnhancersuponTransdermalAbsorptionofFluorouracilThroughMiceSkin

ZOULang1,LIXiao-fang1,DENGHong1,CAOSen2*

1.JiangxiCollegeofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004;2.JiangxiUniversityofTCM,Nanchang330006

OBJECTIVE:To study physicochemical of fluorouracil (5-Fu) and percutaneous effect of transdermal enhancers upon transdermal absorption of 5-Fu through mice skin. METHODS The physicochemical properties in vitro including stability under the condition of illumination, different temperatures and pH and solubility in water, different pH phosphate buffers, oil or surface were determined. The permeation flux of 5-Fu across excised mice skin was determined in vitro using Franz diffusion cell to study the influence of different pH phosphate buffers and the addition of transdermal enhancers. RESULTS The 5-Fu could be stable under the condition of illumination (4500 Lx), 4 ℃，25 ℃，32℃，60 ℃ and pH 5.0，pH 7.4，pH 8.0 phosphate buffers. The solubility of 5-Fu in water and different pH phosphate buffers were greater than that in oil or surfactant. The percutaneous absorption of 5-Fu in water and different pH phosphate buffers in vitro were zero order releasing kinetics. Several enhancers exhibited different effects, the order of effect was eucalyptus oil> peppermint > azone>transcutol P> NMP, CONCLUSIONS 5-Fu was made for W / O microemulsion and eucalyptus oil was the most effective one.

5-Fu; Stability; Solubility; Transdermal Enhancers; Transdermal Role

*通訊作者：曹森(1983-)，男，江西鄱陽人，碩士，助教，Tel：0791-87118777，E-mail：94183761@qq.com。

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2013-05-27)