賈明峰 趙龍 席亞明 陳徹 楚惠媛 郭敏 成娟 李明 張豪 傅思武

艱難梭菌(Clostridium difficile)是引起偽膜性腸炎及抗生素相關(guān)性腹瀉的主要致病菌之一,可產(chǎn)生毒素A和毒素B。毒素A(Tcd A)被認為是艱難梭菌引起疾病發(fā)生的最主要的致病因子,對pH值和溫度變化具有較強的適應(yīng)性。毒素A具有腸道毒性、細胞毒性、小鼠致死活性、紅細胞凝集活性和血管通透性亢進等多種生物學活性[1]。研究表明Tcd A對肝癌、白血病、結(jié)腸癌細胞均具有一定的誘導(dǎo)凋亡、增殖抑制作用[2,3]。本研究主要探討Tcd A對白血病細胞株K562的增殖、凋亡及相關(guān)機制研究,旨在為開發(fā)的抗白血病藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人慢性髓性白血病K562細胞株由蘭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗中心惠贈,于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。艱難梭菌VPI 10463菌株由西北民族大學傅思武教授惠贈,濃度為0.14 mg/ml。

1.2 細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期的K562細胞,調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml,接種于96孔板內(nèi),加入Tcd A,終濃度分別為50、100、200、400、800 ng/ml,以未處理的細胞為對照組,作用24、48、72 h,每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml),培養(yǎng)4h后加入裂解液,放置過夜,振蕩,溶解約10～15 min后,酶標儀測定492 nm處吸光度。計算細胞增殖抑制率(inhibitory rate,IR)。IR=(對照組吸光度－實驗組吸光度/對照組吸光度) ×100%。

1.3 PI單染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期K562細胞,調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml,實驗組加入濃度為800 ng/ml的Tcd A,對照組為等量的未處理細胞懸液,作用48 h后收集細胞。PBS洗滌,重懸細胞于預(yù)冷的70%乙醇,4℃固定2 h,PBS洗滌,加入0.5 ml碘化丙錠(20 μg /ml),避光染色30 min,流式細胞儀分析。

1.4 RT-PCR法檢測細胞BCL-2,Bax,Egr-1mRNA的表達取對數(shù)期生長的細胞,調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml,實驗組分別加入Tcd A,終濃度依次為50、100、200、400、800 ng/ml,對照組為等量的未處理細胞懸液。作用48h后,按照Trizol法提取總RNA,根據(jù)cDNA第一鏈反應(yīng)試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板進行PCR擴增,進行瓊脂糖凝膠電泳PCR,BIO-RAD凝膠成像分析儀上觀察結(jié)果并照相,Quantity One軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測細胞增殖 結(jié)果顯示,不同濃度的Tcd A作用于K562細胞后均能抑制細胞的增殖,實驗組與對照相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著TcdA濃度的增大,抑制率逐漸增加,呈劑量依賴性(表1)。Tcd A濃度為800 ng/ml,作用48 h時的抑制率最大,為47.67%,半數(shù)抑制濃度(IC50)約為 375.83 ng/ml。

表1 Tcd A對K562細胞的增殖抑制作用(±s,n=3)

表1 Tcd A對K562細胞的增殖抑制作用(±s,n=3)

注：與對照組相比*P＜0.05

TcdA(ng/ml) 24h 48h 72h A492nm IR(%) A492nm IR(%) A492nm IR(%)0 0.412±0.011 - 0.675±0.016 - 0.752±0.023 -50 0.311±0.002 24.51* 0.544±0.012 19.40* 0.689±0.007 8.38 100 0.299±0.015 27.42* 0.512±0.004 24.15* 0.641±0.009 14.76 200 0.268±0.008 34.95* 0.461±0.009 31.71* 0.609±0.006 19.02*400 0.241±0.002 41.50* 0.381±0.005 43.56* 0.596±0.005 20.74*800 0.229±0.004 44.41* 0.360±0.004 47.67* 0.587±0.006 21.94*

圖1 Tcd A對K562細胞凋亡的影響

2.3 RT-PCR檢測K562細胞內(nèi)Bcl-2,Bax,Egr-1 mRNA的表達。

不同濃度的Tcd A作用于K562細胞48h后,隨著藥物濃度增加,Bcl-2基因mRNA的表達量逐漸下降,Bax基因mRNA的表達量逐漸增加,Egr-1基因mRNA的表達量逐漸增加。運用Quantity one軟件分析各條帶灰度值,實驗組與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖 2)。

圖2 Tcd A對K562細胞Bcl-2,Bax,Egr-1mRNA表達的影響

3 討論

Tcd A是一種外毒素,通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞而發(fā)揮細胞毒作用。本研究顯示,不同濃度的TcdA對白血病K562細胞均有較強的增殖抑制作用,作用48 h時的抑制率達到47.67%,并隨著藥物劑量的增大抑制率逐漸增大,呈劑量依賴性。流式細胞儀檢測結(jié)果提示,給藥48 h后正常細胞的二倍體峰前出現(xiàn)明顯的亞二倍體峰,即凋亡峰。因此TcdA能誘導(dǎo)K562細胞發(fā)生凋亡。

細胞凋亡是細胞在凋亡基因的調(diào)控下,啟動內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶而發(fā)生的程序性死亡[4]。線粒體/細胞色素C介導(dǎo)的細胞凋亡途徑是主要細胞凋亡途徑之一。細胞在凋亡信號如DNA損傷、神經(jīng)酰胺、Ca2+過載等刺激下,線粒體膜通透性改變,釋放細胞色素C,進而在ATP/dATP存在下,與Apaf-1、Caspase-9前體形成凋亡體,誘導(dǎo)procaspase活化,進而激活Caspase-3,最終導(dǎo)致細胞凋亡?，F(xiàn)普遍認為,細胞色素C的釋放與Bcl蛋白家族成員有關(guān)。Bcl蛋白家族分為兩類,一類是抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcll、Bcl-w等),另一類是促凋亡蛋白(Bax、Bak、Bid和Bad等)。細胞在受到各種刺激后,線粒體外膜間的通透轉(zhuǎn)變孔道開放,基質(zhì)和胞漿內(nèi)的離子得以平衡流動,線粒體基質(zhì)呈現(xiàn)高滲狀態(tài),線粒體腫脹,外膜破裂,膜間隙中的促凋亡蛋白釋放,引起細胞凋亡[5]。Bcl-2蛋白則減少Ca2+的釋放,防止線粒體發(fā)生腫脹,抑制細胞色素C的釋放。而Bax等促凋亡蛋白通過直接或間接途徑形成Bax的異源/同源二聚體,促進通透轉(zhuǎn)變孔道開放?？沟蛲龅鞍譈cl-2等過表達,與Bax蛋白形成異源性二聚體,抑制通透轉(zhuǎn)變孔道開放[6]。因此人們認為抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的失衡是腫瘤發(fā)生的機制之一[7]。本研究中,艱難梭菌毒素A作用K562細胞48h后,隨著藥物濃度的增加,Bcl-2 mRNA表達下調(diào),Bax mRNA表達上調(diào)。

Egr-1基因為即刻早期反應(yīng)基因,位于人類5號染色體q23-31,具有誘導(dǎo)細胞增殖、分化,促進細胞凋亡等多種生物學作用。而其誘導(dǎo)細胞凋亡的機制主要是調(diào)節(jié)TGFβ的表達,誘導(dǎo)野生型P53和下調(diào)Bcl-2基因的表達?？嘴`玲等[8]將外源性的Egr-1質(zhì)粒導(dǎo)入乳腺癌細胞株后,研究發(fā)現(xiàn),隨著Egr-1表達的增加,caspase-3表達水平增加,p-gp表達水平下降,細胞發(fā)生顯著地凋亡。本研究結(jié)果顯示,隨著TcdA濃度的增加,Egr-1基因的表達水平增加,且與Bcl-2 的表達呈負相關(guān)。

綜上所述,TcdA作用于白血病K562細胞株,能夠抑制細胞的增殖,促進細胞的凋亡。而其機制與Bcl-2表達下調(diào),Bax以及Egr-1的表達上調(diào)有關(guān)。艱難梭菌毒素A作用于白血病細胞,是否還有其他機制參與,需要我們更加深入的研究。

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