范治軍 李科 劉士煜 王煥坤

茶多酚是茶的有效成分,對多種腫瘤細(xì)胞具有直接殺傷作用,并能提高放療的敏感性,其增敏機(jī)制可能與影響細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本文通過體外培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞,分為單純放療與放療加茶多酚兩組,用MTT法觀察兩組細(xì)胞生長的抑制情況,用流式細(xì)胞儀檢測兩組間細(xì)胞周期的改變,及用電子顯微鏡觀察兩組細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況,介紹如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)對象 人鼻咽低分化鱗狀上皮癌細(xì)胞系CNE-2。

1.2 試劑 茶多酚、小牛血清、PBS液、1640培養(yǎng)液、胰酶消化液。

1.3 器材 CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、電子顯微鏡

2 方法及觀察指標(biāo)

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將CNE-2細(xì)胞培養(yǎng)于含有新生小牛血清,青霉素、鏈霉素各100 U/ml及碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4的1640培養(yǎng)液中,置于37℃恒溫5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 照射方法 將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中,貼壁后用直線加速器6MV線照射。照射條件：劑量率108～111 cGy/min,放射源距細(xì)胞生長面80 cm,機(jī)頭和機(jī)架角度均為0,細(xì)胞上方培養(yǎng)液深度5 mm,作為照射所需劑量的建成區(qū),照射野大小30 cm×30 cm,照射細(xì)胞擺放位于照射野邊緣2 cm以內(nèi)的區(qū)域。

2.3 MTT法檢測細(xì)胞抑制情況 將細(xì)胞接種于96孔板,貼壁后加入濃度依次5、10、15、20、25、30 μg/ml的茶多酚培養(yǎng)48h,檢測前加MTT,培養(yǎng)4 h,加DMSO,全自動(dòng)酶標(biāo)儀比色檢測,測吸光度A值。計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50),用IC50濃度的茶多酚作用腫瘤細(xì)胞,分為單純放療組和放療加茶多酚組,并設(shè)空白對照,在第1到第4天依次用MTT法比色檢測,觀察兩組間細(xì)胞生長抑制率的差異。細(xì)胞生長抑制率(%)=(對照組A-實(shí)驗(yàn)組A)/對照組A×100%。

2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中,貼壁后分單純放療和放療加茶多酚兩組,后組所加茶多酚為上述IC50的濃度,藥物作用24 h后,分別用直線加速器照射細(xì)胞,照射后再培養(yǎng)24 h,按照流式細(xì)胞儀檢測前標(biāo)本準(zhǔn)備流程處理細(xì)胞,上機(jī)檢測分析細(xì)胞周期,收集數(shù)據(jù),在MultiCycle分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析,計(jì)算G1、S、G2/M期的相對比例。

2.5 電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中,貼壁后分為單純放療組和放療加茶多酚組,其中后組所加茶多酚為上述IC50的濃度,藥物作用24 h后,分別用直線加速器照射細(xì)胞,照射后再培養(yǎng)24 h,按照電子顯微鏡標(biāo)本常規(guī)制作方法處理標(biāo)本,在透射電鏡下觀察細(xì)胞。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用t檢驗(yàn)和成組單因素方差(One-way ANVOA)分析,(P＜0.01)或(P＜0.05)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MTT法檢測結(jié)果 不同濃度茶多酚作用48 h對CNE-2細(xì)胞增殖的影響。見表1。

表1 不同濃度茶多酚作用48 h對CNE-2細(xì)胞增殖的影響(±s)

表1 不同濃度茶多酚作用48 h對CNE-2細(xì)胞增殖的影響(±s)

注：與對照組相比▲P＜0.01,所測IC50=22.94 μg/ml

組別 OD(無密度) 值抑制率對照組 0.345±0.013 5 μg/ml 0.329±0.014 4.6%10 μg/ml 0.315±0.002 8.6%15 μg/ml 0.310±0.003 10.0%20 μg/ml 0.268±0.034 21.9%25 μg/ml 0.159±0.007▲ 53.8%30 μg/ml 0.027±0.009▲ 92.0%

兩組隨時(shí)間延長對CNE-2細(xì)胞增殖的影響。見表2。

3.2 細(xì)胞周期檢測結(jié)果 G2/M期比例下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表2 隨時(shí)間延長2組對CNE-2細(xì)胞增殖的影響(±s)

表2 隨時(shí)間延長2組對CNE-2細(xì)胞增殖的影響(±s)

注：單純放療組與茶多酚加放療組相比★P＜0.05,▲P＜0.01

時(shí)間(d) 空白對照組 單純放療 茶多酚加放療OD值 OD值 抑制率 OD值 抑制率1 0.286±0.008 0.138±0.007 52.1% 0.104±0.006 63.5%2 0.345±0.013 0.184±0.003 46.5%★ 0.159±0.007★ 53.8%3 0.579±0.050 0.274±0.008 52.7%▲ 0.222±0.025▲ 61.2%4 0.725±0.028 0.287±0.006 60.3%▲ 0.150±0.013▲ 79.8%

表3 兩組間細(xì)胞周期的差異(±s)

表3 兩組間細(xì)胞周期的差異(±s)

單純放療組與茶多酚加放療組相比★P＜0.05

組別 G1(%) S(%) G2/M(%)空白對照組 56.4±3.2 12.5±5.5 32.3±4.5單純放療組 55.7±5.2 32.1±4.2 12.1±2.6★茶多酚加放療組 67.2±4.8 26.5±6.3 5.1±1.9★

3.3 透射電鏡觀察顯示 單純放療組在照射24 h后出現(xiàn)核膜稍完整,胞漿空泡化,染色體聚集成團(tuán)塊狀,在核周圍產(chǎn)生凋亡小體(圖1)；茶多酚加放療組在照射24 h后細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不清,細(xì)胞凋亡明顯,大量凋亡小體產(chǎn)生(圖2)。

圖1

圖2

4 討論

大量研究顯示茶多酚在體外有抗腫瘤作用[1],本實(shí)驗(yàn)中,通過MTT法顯示茶多酚對鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的生長有抑制作用,在48 h內(nèi),隨著劑量的增加,抑制作用逐漸增強(qiáng)。有實(shí)驗(yàn)顯示茶多酚具有放療增敏作用[2-4],本文中實(shí)驗(yàn)分單純放療和放療加茶多酚兩組,通過MTT法顯示,隨著時(shí)間延長,抑制作用逐漸增加,且放療加茶多酚組抑制作用強(qiáng)于同時(shí)間的單純放療組。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,觀察到茶多酚加放療組,進(jìn)入G2/M期的細(xì)胞比例較單純放療組更加減少,說明其提高了放射敏感性,因?yàn)榉暖熤饕獙2/M期細(xì)胞殺傷作用顯著,可見由于茶多酚的加入,使得大量G2/M期細(xì)胞被殺滅,因而G2/M期的細(xì)胞比例減少明顯。在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),由于茶多酚的加入,使照射后的細(xì)胞發(fā)生凋亡的時(shí)間縮短,發(fā)生凋亡的細(xì)胞增多。茶多酚提高放療敏感性可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以及誘導(dǎo)凋亡有關(guān),茶多酚可以通過抑制細(xì)胞周期素的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞周期素依賴激酶活性的變化,改變細(xì)胞周期[5]。亦可以誘導(dǎo)p53的表達(dá),p53與特定序列的DNA結(jié)合,促使細(xì)胞周期發(fā)生改變[6]。茶多酚能參與調(diào)控某些癌基因或抑癌基因的表達(dá),能抑制促癌劑引起的癌變正相關(guān)基因的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。還可能在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑是由于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II受到抑制所體現(xiàn)[7]。本實(shí)驗(yàn)僅通過體外實(shí)驗(yàn)初步觀察到茶多酚對放療的增敏作用,尚需通過體內(nèi)大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察和驗(yàn)證。

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