姚輝，張建華，毛忠貴

1(江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

2(江南大學生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

1957 年Kinoshita 等發(fā)現(xiàn)并分離了谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，開啟了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸的新時代［1］。有研究表明，谷氨酸棒桿菌在正常生長條件下不分泌谷氨酸，只有通過下面4種措施才能誘導谷氨酸分泌:(1)生物素亞適量［2－3］;(2)添加表面活性劑［4］;(3)添加青霉素［5］;(4)利用甘油或油酸營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵［6－7］。雖然研究人員對于如何誘導谷氨酸分泌已有較清楚的認識，但是對于谷氨酸分泌的機理卻一直沒有定論。

關于谷氨酸的分泌目前有以下3 種假定模式:“泄漏”模式［2］、“載體功能逆轉(zhuǎn)”模式［8］及“特殊載體系統(tǒng)”模式［9－10］。這3 種假定模式是從細胞膜的組成、載體蛋白等方面研究谷氨酸的分泌。目前，與“泄漏”模式相關的生物素“亞適量”發(fā)酵法是生產(chǎn)谷氨酸的主要發(fā)酵方法，該方法通過生物素的濃度控制菌體的生長與谷氨酸的分泌。生物素是生物細胞必需微量營養(yǎng)因子，它的8 種同分異構體中只有D-(+)-生物素具有生物活性，生物素主要是作為某些酶的輔酶，如乙酰-CoA 羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酰-CoA 羧化酶、β-甲基巴豆酰-CoA 羧化酶等，這些酶可以催化羧基的脫落、轉(zhuǎn)移和固定;此外生物素還參與碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)和核酸的代謝，并且還對基因的表達產(chǎn)生影響。

自然界中的生物素大都以游離狀態(tài)存在，但也有部分通過戊酸支鏈和蛋白質(zhì)中賴氨酸的ε-氨基共價結(jié)合的方式存在［11］。生物素檢測主要有微生物法、生物法、儀器分析法和親和分析法等方法［12］。微生物法檢測限較高，但特異性不強并且繁瑣耗時;生物法只能檢測生物能夠利用的生物素;儀器分析法簡單、快速，但不能區(qū)分生物素和生物素的代謝類似物;親和分析法精確性高、檢測限低、省時，并可對復雜的樣品進行有效分析［11］。由于谷氨酸發(fā)酵液中生物素極微量，約5 ～10 μg/L［13］，對檢測限要求極高，且會受到發(fā)酵液中蛋白質(zhì)、色素等成分的干擾，導致直接測定發(fā)酵液中生物素濃度的難度較大。糖蜜、玉米漿中所含生物素在發(fā)酵過程中是等量分配到每個細胞的［14］，因此作者通過控制其添加量來調(diào)節(jié)初始生物素含量，同時測定培養(yǎng)過程中的菌體干重，計算單位干重菌體占有生物素的量，以此來間接表示發(fā)酵過程中生物素的濃度，稱之為名義生物素濃度，單位是μg/g DCW。本文通過研究發(fā)酵過程中名義生物素濃度對胞內(nèi)外谷氨酸濃度變化，探討生物素對谷氨酸棒桿菌分泌谷氨酸的影響機制以及觸發(fā)谷氨酸分泌的生物素“亞適量”域值，探求其對生產(chǎn)的指導意義。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicumS9114，江南大學發(fā)酵與生態(tài)工學實驗室保藏，－40℃保藏于石蠟管中。

1.1.2 培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏10，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.0 ～7.2。

活化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.0 ～7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50，糖蜜15，玉米漿50，H3PO40.64，K2HPO43.2，MgSO40.4，pH 7.0 ～7.2。葡萄糖、糖蜜、玉米漿根據(jù)實驗需要有所變動。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖160，糖蜜1.5，玉米漿6，Na2HPO41，KCl 2.2，MgSO41。

生物素測定培養(yǎng)基(g/L):分析純葡萄糖145，MgSO40.65，K2HPO41.6，KCl 0.3，F(xiàn)eSO4、MnSO4各0.002，pH 7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物素測定方法

微生物法［15］。

1.2.2 胞內(nèi)谷氨酸測定方法

于2mL 離心管中依次加入21%高氯酸溶液300 μL，硅油500 μL(相對密度1.07;KF-54;Shin-etsu Chemical Industry Co. Ltd. ，Tokyo)，發(fā)酵液500 μL，離心(64 000 ×g，5 min，4℃)，含有菌體的高氯酸層經(jīng)超聲破碎、中和后測定胞內(nèi)的谷氨酸［16］。細胞質(zhì)容積約為1.6 μL/mg DCW［10］。

1.2.3 菌體培養(yǎng)

將一新鮮斜面洗入2L 種子培養(yǎng)基中，33℃，pH 7.0，轉(zhuǎn)速按照溶氧要求自動調(diào)節(jié)，培養(yǎng)至葡萄糖耗盡。

1.3 檢測方法

谷氨酸、葡萄糖采用SBA-40D 生物傳感分析儀測定，吸光度采用721 可見分光光度計測定。

2 實驗結(jié)果

2.1 生物素測定

采用微生物法測定了糖蜜、玉米漿中生物素的含量，其標準曲線如圖1，實驗得到糖蜜和玉米漿生物素添加回收率分別為102.4%、118.7%。經(jīng)生物素添加回收率實驗校正，糖蜜中生物素含量為2 561 ±148 μg/kg，玉米漿中生物素含量為652 ±24 μg/kg。發(fā)酵過程中的菌體干重通過繪制菌體吸光度與菌體干重標準曲線來測定，標準曲線如圖2，從R2=0.985可以看出菌體干重和菌體吸光度有著良好的線性關系。

2.2 生物素濃度對C. glutamicum S9114 培養(yǎng)的影響

圖1 生物素標準曲線Fig.1 Biotin standard curve

圖2 菌體干重標準曲線Fig.2 Dry cell weight standard curve

研究中發(fā)現(xiàn)，谷氨酸棒狀桿菌在種子培養(yǎng)階段就開始在胞內(nèi)合成谷氨酸。通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基中糖蜜和玉米漿的添加量，使初始生物素濃度分別為20、46、69 μg/L，發(fā)酵通過流加氨水調(diào)節(jié)pH，直至葡萄糖消耗完全時結(jié)束發(fā)酵。實驗考察了初始生物素濃度對胞內(nèi)谷氨酸、胞外谷氨酸、生物素及菌體吸光度進行監(jiān)測，結(jié)果見圖3。

圖3a、b、c 表明，菌體生長與生物素密切相關，初始生物素濃度越高，菌體生長越快，且最終菌體量也越高。

胞內(nèi)谷氨酸濃度變化趨勢為，在培養(yǎng)初始階段胞內(nèi)谷氨酸濃度很低，大概0 ～4 g/L。之后逐漸升高，在第12 h 左右達到最高點35 ～60 g/L(圖3a:60 g/L、b:49 g/L、c:35 g/L)。初始生物素濃度越高，胞內(nèi)谷氨酸濃度峰值就越低。之后胞內(nèi)谷氨酸濃度開始逐漸下降，這是由于胞內(nèi)谷氨酸開始向胞外分泌所致，最后胞內(nèi)谷氨酸濃度維持在某一穩(wěn)定水平20 ～40 g/L(圖3a:40 g/L、b:20 g/L、c:23 g/L)。

亞適量法谷氨酸正常發(fā)酵中，最后產(chǎn)量通常120 g/L 左右，但胞內(nèi)谷氨酸最高濃度大約在60 g/L 左右，胞外谷氨酸濃度遠高于胞內(nèi)谷氨酸濃度，顯然“泄漏”模式不能解釋谷氨酸的分泌。

初始生物素水平不會影響谷氨酸開始分泌的時間，檢測到胞外谷氨酸時胞內(nèi)谷氨酸約為32 ～47g/L(圖3a:47g/L、b:42g/L、c:32g/L)，對應的名義生物素濃度約為2.0 ～2.29 μg/g DCW(圖3a:1.97 μg/g DCW、b:2.03 μg/g DCW、c:2.29 μg/g DCW)?？芍?，檢測到胞外谷氨酸時的對應的名義生物素濃度集中在某一范圍內(nèi)，推測谷氨酸的分泌很可能是由生物素控制。

圖3 初始生物素濃度對C. glutamicum S9114 培養(yǎng)的影響Fig.3 The effect of initial biotin concentration on C. glutamicum S9114

2.3 生物素“名義亞適量”濃度

控制起始生物素濃度在16 ～69 μg/L，共進行6 批次發(fā)酵試驗，根據(jù)胞內(nèi)、胞外谷氨酸濃度變化，統(tǒng)計得到的生物素“名義亞適量”濃度如表1 所示。所以谷氨酸發(fā)酵中觸發(fā)谷氨酸分泌的“名義生物素亞適量”濃度范圍在1.97 ～2.29 μg/g DCW。

表1 不同初始生物素水平下生物素“名義亞適量”濃度Table 1 The“nominal biotin-limitation”concentration under different initial biotin concentration

2.4 添加生物素對谷氨酸分泌的影響

為了驗證生物素在谷氨酸分泌中所起的作用，進行了在正常發(fā)酵產(chǎn)生谷氨酸的條件下添加生物素實驗，結(jié)果見圖4。

圖4 添加生物素對谷氨酸分泌的影響“→”添加生物素時間Fig.4 The effect of supplement biotin on glutamic acid secretion

圖4 中，起始生物素濃度約為16 μg/L，可以看出，在0 ～8 h 的發(fā)酵過程中，發(fā)酵結(jié)果正常，胞內(nèi)谷氨酸初始濃度39 g/L，這時胞內(nèi)谷氨酸并未向外分泌，但由于谷氨酸的合成使得胞內(nèi)谷氨酸濃度略有升高，之后由于胞內(nèi)谷氨酸向胞外分泌，使胞內(nèi)谷氨酸濃度下降并維持在36 g/L 左右。在第4h 時檢測到胞外谷氨酸，此時胞內(nèi)谷氨酸濃度35 g/L，對應的生物素濃度1.99 μg/g DCW，與2.3 中所述生物素亞適量范圍一致。在第8h時再次添加20 μg/L 生物素，使發(fā)酵液中生物素濃度由1.04 μg/g DCW 瞬間上升到2.34μg/g DCW。添加生物素后胞外谷氨酸便不再增加，一直維持在11 ～12 g/L，但胞內(nèi)谷氨酸逐漸從36g/L 上升到61 g/L，并且菌體進入到第2 個對數(shù)生長期，這一實驗現(xiàn)象再次表明，生物素是控制谷氨酸分泌的關鍵因素，當生物素濃度在亞適量范圍內(nèi)時胞內(nèi)谷氨酸才會向胞外分泌。

3 討論

谷氨酸的分泌機理到目前為止還不是很清楚，本文研究了生物素對胞內(nèi)、胞外谷氨酸及對谷氨酸分泌等幾方面的影響，從而達到對谷氨酸分泌模式進行初探的目的。

在2.2 不同生物素水平實驗中，測得胞內(nèi)谷氨酸濃度范圍在0 ～60 g/L，而在正常的谷氨酸發(fā)酵后期谷氨酸濃度通常在120 g/L，胞外谷氨酸濃度遠高于胞內(nèi)谷氨酸濃度，如果谷氨酸的分泌是“泄漏”模式，那么此時谷氨酸應從胞外向胞內(nèi)泄漏，但這明顯與事實不符。所以，“泄漏”模式不能解釋谷氨酸的分泌。并且在實驗中，檢測到胞外谷氨酸時的名義生物素濃度集中在1.97～2.29 μg/g DCW，推測谷氨酸的分泌很可能是由生物素控制的。

經(jīng)統(tǒng)計得到“名義生物素亞適量”濃度范圍在1.97～2.29 μg/g DCW，且在2.4 的實驗中測得谷氨酸分泌時的名義生物素濃度為1.99 μg/g DCW，在“名義生物素亞適量”濃度范圍內(nèi)。之后向發(fā)酵液中添加生物素，使瞬時名義生物素濃度升高至2.34 μg/g DCW，高于“名義生物素亞適量”濃度范圍，此時谷氨酸的分泌停止。這直接證明了谷氨酸分泌受生物素濃度控制。所以本文提出谷氨酸分泌的一個新的假定模式:“生物素濃度觸發(fā)式分泌”模式，即在亞適量法谷氨酸發(fā)酵中，當生物素豐富時，谷氨酸不向胞外分泌;而當生物素“亞適量”時，胞內(nèi)的谷氨酸開始向胞外分泌，如圖5。

圖5 谷氨酸分泌模式圖Fig．5 Glutamic acid secretion mode

4 結(jié)論

(1)“泄漏”模式不能解釋谷氨酸的分泌。在谷氨酸正常發(fā)酵后期胞外谷氨酸濃度通常為120 g/L，而胞內(nèi)谷氨酸濃度最高為60 g/L 左右，胞內(nèi)谷氨酸濃度遠遠低于胞外谷氨酸濃度，此時胞內(nèi)谷氨酸不能向外泄漏。

(2)生物素“亞適量”是觸發(fā)谷氨酸分泌的關鍵因素。本文通過生物素添加實驗直接證明生物素的濃度可以控制谷氨酸的分泌，并測得“名義生物素亞適量”濃度范圍在1.97 ～2.29 μg/g DCW。

(3)谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物素初始含量會隨糖蜜和玉米漿來源、批次的不同出現(xiàn)波動，進而影響谷氨酸發(fā)酵性能和穩(wěn)定性。通過實驗，發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌生物素“名義亞適量”的范圍通常在1.97 ～2.29 μg/g DCW，并且在谷氨酸正常發(fā)酵中菌體量是穩(wěn)定在某一范圍內(nèi)。只要測定不同來源、批次的糖蜜和玉米漿中生物素的含量，然后根據(jù)發(fā)酵液中菌體量和生物素“名義亞適量”范圍，折合成初始糖蜜、玉米漿添加量，這樣可以較方便地控制谷氨酸發(fā)酵。

［1］ Kinoshita S，Udaka S，Shimono M.Studies on the amino acid fermentation Part I.Production ofL-glutamic acid by various microorganisms［J］． Journal of General Microbiology，2004，50(6):331 －43.

［2］ Shiio I，Otsuka S，Takahashi M.Effect of biotin on the bacterial formation of glutamic acid I.Glutamate formation and cellular permeability of amino acids ［J］． J Biochem，1962，51(1):56 －62.

［3］ Clement Y，Laneelle G.Glutamate excretion mechanism inCorynebacterium glutamicum:triggering by biotin starvation or by surfactant addition［J］． Journal of General Microbiology，1986，132(4):925 －929.

［4］ Takinami K，Yoshii H，Tsuri H，et al.Biochemical effects of fatty acid and its derivatives onL-glutamic acid fermentation.Part III .Biotin-Tween 60 relationship in the accumulation ofL-glutamic acid and the growth ofBrevibacterium lactofermentum［J］． Agric Biol Chem，1965，29(1):351 －359.

［5］ Nara T，Samejima H，Kinoshita S.Effect of penicillin on amino acid fermentation ［J］． Agric Biol Chem，1964，28(1):120 －124.

［6］ Nakao Y，Kikuchi M，Suzuki M，et al.Microbial production of glutamic acid by glycerol auxotrophs.I.Induction of glycerol auxotrophs and production ofL-glutamic acid from nparaffins［J］． Agricultural Biology and Chemistry，1972，36(3):490 －496.

［7］ Kitano K，Sugiyama Y，Kanzaki T.L-Glutamate fermentation with acetic acid by an oleic requiring mutant.II.Inhibitory factors against the extracellular accumulation ofL-glutamate［J］． Journal of Fermentation，Technology 1972，50(4):182 －191.

［8］ Clement Y，Escoffier B，Trombe MC，et al.Is glutamate excreted by its uptake system inCorynebacterium glutamicumA working hypothesis［J］． Journal of General Microbiology，1984，130(10):2 589 －2 594.

［9］ Christian H，Reinhard K.Evidence for an efflux carrier system involved in the secretion of glutamate byCorynebacterium glutamicum［J］． Arch Microbiology，1989，151(4):342 －347.

［10］ Marcella G，Christian H，Reilhard K.Carrier-mediated glutamate secretion byCorynebacterium glutamicumunder biotin limitation ［J］． Biochimica et Biophysica Acta，1992，1112(1):115 －123.

［11］ John O N，Dionyssis S I，Gregory P E.Analytical techniques for determining biotin［J］． Journal of Chromatography A，2000，881(1):331 －343.

［12］ Yuo-Sheng Chang，Chwen-Huey Wu，Re-Jiin Chang． Determination of biotin concentration by a competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)method［J］．1994，29(3):321 －329.

［13］ 張立德. 談談谷氨酸發(fā)酵［J］． 發(fā)酵科技通訊，2000，29(3):14 －16.

［14］ 邱立友. 生物素亞適量辨析［J］． 發(fā)酵科技通訊，1997，26(1):17 －18.

［15］ 刁立蘭. 谷氨酸發(fā)酵中生物素含量的測定及控制［D］． 青島:山東輕工業(yè)學院，2008:1 －71.

［16］ Ayaaki Ishizaki，Koh Yamamoto，Yoshifumi Furuta.A new method for the accurate and rapid determination of the concentrations of intracellular metabolites in cells during fermentation［J］． Biotechnology Techniques，1995，9(6):409 －412.