張康 ，梅倩 ，李祥 ，趙亞力 ，韓為東 ，孟元光

解放軍總醫(yī)院 a.婦產(chǎn)科；b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)所分子生物室；北京 100853

微小RNA（microRNA，miRNA）是近年研究較為廣泛的一類小分子非編碼調(diào)控的內(nèi)源性單鏈RNA，由19～25個核苷酸組成，通過與mRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，降解mRNA或抑制其翻譯，使基因在轉(zhuǎn)錄后水平產(chǎn)生沉默，調(diào)控基因表達(dá)[1]。目前，人類基因組中已確認(rèn)數(shù)以千計的miRNA，可能參與人類30%的蛋白質(zhì)的表達(dá)調(diào)控，對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡、代謝、應(yīng)激反應(yīng)及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程都有重要的作用[2-5]。隨著越來越多新的miRNA及其功能的不斷發(fā)現(xiàn)，miRNA作為生物體重要的基因調(diào)控分子，與疾病的關(guān)系尤其是與腫瘤的關(guān)系成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。

目前，研究miRNA功能多采用人工合成miRNA擬似物或拮抗物，但其作用時間短，難以適應(yīng)腫瘤等漸進(jìn)性疾病的研究。作為真核生物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的載體系統(tǒng)之一，人類免疫缺陷病毒1（HIV-1）來源的慢病毒載體越來越受到重視[6]。本研究旨在針對miRNA-455（miR-455）開展慢病毒質(zhì)粒載體的構(gòu)建研究，以探討miR-455在宮頸癌中的作用機(jī)制和利用慢病毒進(jìn)行基因治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞株SiHa、病毒包裝細(xì)胞293T（本實驗室保存，為貼壁細(xì)胞）；大腸桿菌TOP10（天根生化公司）；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；慢病毒表達(dá)載體pWPT-GFP、輔助包裝原件載體pMD2G和 pSPAX2（本實驗室保存）（圖 1）；TRIzol試劑、Li?pofetAMINE2000（Invitrogen公 司）；SYBR Realtime PCR Master Mix（TOYOBO公司）；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、MluⅠ及T4DNA連接酶（NEB公司）；D2000 DNA marker（大連寶生物工程公司）；小量質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒（SBS公司）；質(zhì)粒大提試劑盒（QIAGEN公司）。

1.2 PCR擴(kuò)增pri-miR-455

通過EMBL數(shù)據(jù)庫獲得has-miR-455初始形式（pri-miR-455）的序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計引物并由Invitrogen公司合成（引物F：5'CGGGATCCT GGCACAATGTTGGCAC3'；引 物 R：5'CGACGCGTG AAGCAAACTTACTCGT3'，上下游引物分別含有BamHⅠ和MluⅠ酶切位點）；以正常人基因組DNA為模板擴(kuò)增，反應(yīng)程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)，每管 20 μL體系；純化并回收PCR產(chǎn)物。

1.3 miR-455慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

圖1 pWPT-GFP質(zhì)粒圖譜

PCR擴(kuò)增pri-miR-455，載體質(zhì)粒為pWPTGFP，酶切位點為BamHⅠ和MluⅠ，酶切4 h使其線性化后，以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定比例，確定連接比例，進(jìn)行連接。酶切回收載體DNA（100 ng/μL）1 μL，退火雙鏈 DNA（100 ng/μL）6 μL，10×T4噬菌體DNA 連接酶緩沖 液 2 μL，T4DNA 連 接 酶 1 μL，ddH2O 10 μL，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化細(xì)菌。陽性克隆PCR鑒定：上、下游引物各0.5 μL，2×Tap PCR Mas?ter Mix 10 μL，菌落裂解液 1 μL（陽性對照組不加，陰性對照組加水），由ddH2O配置反應(yīng)體系為20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃熱啟動30 s；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s,30個循環(huán)，72℃聚合6 min。分別挑選3個序列的陽性克隆送華大基因公司測序鑒定。

1.4 質(zhì)粒抽提

用QIAGEN公司試劑盒抽提3種質(zhì)粒，參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 慢病毒重組體的包裝、感染

胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以5×105接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pWPT-GFP-pri-miR-455及2種輔助包裝原件載體質(zhì)粒 pSPAX2、pMD2G，按照 4∶2∶1的比例混合，用LipofetAMINE2000共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染5 h后更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48、72 h后分別收集培養(yǎng)上清，感染未轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞。

1.6 Real-time定量PCR檢測慢病毒感染后miR-455的表達(dá)

小量包裝獲得的慢病毒轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞，感染3 d后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，若感染率低于50%則重新轉(zhuǎn)染；若感染率超過50%，待感染5 d后，選擇3～5個視野/孔，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)綠色熒光細(xì)胞的平均數(shù)與總細(xì)胞平均數(shù)的比值，估計質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。收集細(xì)胞，用Real-time定量PCR方法檢測miR-455的表達(dá)，進(jìn)而判斷病毒的感染效率。PCR方法同上。定量數(shù)值采用2-ΔΔCt方法計算。每組重復(fù)3次實驗。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗結(jié)果用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用配對t檢驗，P＜0.05示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pri-miR-455的擴(kuò)增

以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為550 bp的片段（圖2），DNA測序證明擴(kuò)增片段的核苷酸序列與GenBank中的pri-miR-455序列完全一致（序列未示）。

2.2 pWPT-GFP-pri-miR-455重組質(zhì)粒的陽性克隆鑒定

pWPT-GFP-pri-miR-455重組質(zhì)粒陽性克隆的PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳見圖3，經(jīng)測序，1～8號均正確。

2.3 質(zhì)粒pWPT-GFP-pri-miR-455對293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

圖2 pri-miR-455 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

先鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒對293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率在90%以上（圖4A）；以2-ΔΔCt分析法計算，轉(zhuǎn)染48 h后miR-455的表達(dá)量提高了37.1倍（圖4B）。

2.4 慢病毒對SiHa細(xì)胞的感染效率

先鑒定構(gòu)建的慢病毒上清對SiHa細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，感染效率在90%以上（圖5A）；以2-ΔΔCt分析法計算，病毒感染后miR-455的表達(dá)量上調(diào)近40倍（圖5B）。

3 討論

miRNA作為一類具有基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用的小分子，參與各種生物體的生理和病理功能[7]，約30%的蛋白編碼基因受其調(diào)控[8]，其功能研究是近年來人們一直關(guān)注的話題。

圖3 載體pWPT-GFP-pri-miR-455的測序結(jié)果

圖4 質(zhì)粒pWPT-GFP-pri-miR-455對293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

圖5 慢病毒上清對SiHa細(xì)胞的感染效率

目前研究miRNA功能及機(jī)制的方法較多，但大致分為過表達(dá)或抑制表達(dá)兩種方式。過表達(dá)研究又常選用瞬時轉(zhuǎn)染或構(gòu)建表達(dá)載體方法。瞬時轉(zhuǎn)染可將人工合成的miRNA或其靶基因擬似物（mimics）[9]這些短序列，通過轉(zhuǎn)染方式使其在體內(nèi)發(fā)揮作用。此類方法實施起來方便快捷，但所建立的miRNA功能獲得或缺失的動物模型無法適應(yīng)長期研究，更無法進(jìn)行傳代。通過慢病毒包裝技術(shù)可解決這一問題，尤其是miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用等研究中，模式動物的建立將會發(fā)揮更大作用。

慢病毒載體是以HIV-1為基礎(chǔ)發(fā)展起來的新興載體，可以高效感染分裂期及非分裂期細(xì)胞，具有方法簡單、目的基因整合率高并長期表達(dá)、免疫原性低等優(yōu)點。此外，慢病毒為“自殺”性病毒，感染目的細(xì)胞后不會再感染其他細(xì)胞及產(chǎn)生新的病毒顆粒，安全性高，因而是一種強有力的基因運輸工具，已成為當(dāng)前基因治療中載體研究的熱點。

我們采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了miR-455慢病毒表達(dá)載體，并建立了基于SiHa細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，為進(jìn)一步鑒定miR-455在宮頸癌中的作用靶點及對其進(jìn)行功能研究提供了有力支持。

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