劉甦蘇 ，周舒雅 ，高正琴 ，左琴 ，岳秉飛 ，賀爭(zhēng)鳴 ，劉佐民 ，張冰 ，范昌發(fā)

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院 國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心，北京 100050

隨著20世紀(jì)70年代轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型越來越多地被用于人類疾病的相關(guān)研究。傳統(tǒng)的建立轉(zhuǎn)基因模型的方法，是將人工分離或修飾過的基因通過顯微注射系統(tǒng)等導(dǎo)入受體基因組，由于導(dǎo)入基因（即轉(zhuǎn)基因）的表達(dá)，可引起生物體遺傳性狀的修飾。由于轉(zhuǎn)基因?yàn)殡S機(jī)插入受體基因組，轉(zhuǎn)基因的整合和表達(dá)效率，及其在世代傳遞中能否穩(wěn)定遺傳是研究者關(guān)注的問題[1]。位置效應(yīng)[2]、外源基因的表觀遺傳學(xué)修飾[3-5]和遺傳效率[6-7]是研究外源基因沉默機(jī)制的三個(gè)主要方面。但是，完全弄清楚上述機(jī)制是非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作，通?？梢酝ㄟ^監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平、組織分布及遺傳穩(wěn)定性來間接證實(shí)，并由此判斷轉(zhuǎn)基因模型是否可用。

C57-ras癌癥動(dòng)物模型是本單位通過原核注射方法，將人源原癌基因c-Ha-ras導(dǎo)入C57BL/6小鼠基因組中自主建立的，旨在根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）指導(dǎo)原則S1B[8]的要求，用于新藥臨床前致癌性安全評(píng)價(jià)，在我國(guó)建立基于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的致癌性安全評(píng)價(jià)替代方法[9-10]。

我們擬通過半定量和熒光定量PCR方法，分析轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras在小鼠各組織中的表達(dá)，并比較其表達(dá)量，以期為首建鼠系的遴選、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因是否穩(wěn)定遺傳等提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

C57-ras模型為通過原核注射方法將人源原癌基因c-Ha-ras導(dǎo)入C57BL/6小鼠基因組的方法自主建立，模型小鼠飼養(yǎng)于國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心［SCXK（京）2009-0017］，繁育環(huán)境為SPF級(jí)，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)在清潔級(jí)環(huán)境中進(jìn)行。首建鼠系為No.2、No.3和No.5，系按照獲得首建鼠的時(shí)間順序編號(hào)確立。多數(shù)情形下，每次實(shí)驗(yàn)取3只小鼠，數(shù)據(jù)為3只小鼠的平均值，或?qū)?只小鼠的RNA樣品等量混合，在相同條件下進(jìn)行半定量或定量PCR分析。本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。

TRIzol試 劑 、RT-PCR 試 劑 盒 、SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；Fast Reaction八連管及蓋購(gòu)自ABI公司；TE緩沖液、TAE緩沖液參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》自行配置；其他常見生化試劑如乙醇、異戊醇、苯、氯仿等購(gòu)自北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司；檢測(cè)儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀、Thermo nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)；引物由諾賽基因公司合成（表1）。

1.2 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

TRIzol法提取總RNA，取等量各組織總RNA，除去基因組DNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄采用寶生物公司的Prime Script RT reagent Kit，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 20 μL，其中總RNA 1 μL，具體操作參照說明書。逆轉(zhuǎn)錄得到c-Ha-ras基因cDNA后，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 半定量RT-PCR檢測(cè)不同組織中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平

根據(jù)c-Ha-ras基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物，上游引物為RT-PFEX1，下游引物為RT-PREX4，目的片段長(zhǎng)580 bp，選擇GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因。取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以等量cDNA為模板分別擴(kuò)增相應(yīng)基因，產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。如果GAPDH基因擴(kuò)增成功，表明反應(yīng)體系正常，無論c-Ha-ras基因是否獲得擴(kuò)增，結(jié)果均可信；反之，如果GAPDH基因擴(kuò)增不成功，無論c-Ha-ras基因是否獲得擴(kuò)增，本次結(jié)果不可取，須重復(fù)。內(nèi)對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組在相同條件下同時(shí)進(jìn)行。

1.4 熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）檢測(cè)不同組織中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平

同樣選用GAPDH為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，c-Ha-ras基因特異上游引物為RQ-RAS-F，下游引物為RQ-RAS-R，目的片段長(zhǎng)177 bp。測(cè)定cDNA濃度并稀釋至50 ng/μL。qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNase H Plus）（2×）10.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.3 μL，cDNA 模板 2 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s預(yù)變性，隨后95℃ 5 s、62℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

熒光素設(shè)定為SYBR GreenⅠ，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。檢測(cè)采用real-time PCR相對(duì)定量法（ΔΔCt法）[11]，qRT-PCR 結(jié)果用 2-ΔΔCt進(jìn)行分析，計(jì)算轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras在C57-ras癌癥小鼠各組織中的相對(duì)表達(dá)量。

表1 半定量RT-PCR及qRT-PCR引物序列及退火溫度

2 結(jié)果

2.1 半定量PCR和qRT-PCR方法的建立

根據(jù)轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras的外顯子區(qū)域和內(nèi)參基因GAPDH序列設(shè)計(jì)引物，并通過梯度PCR優(yōu)化退火溫度，以擴(kuò)增出單一條帶為最佳退火溫度。將同一樣品同時(shí)擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因和內(nèi)參基因，當(dāng)內(nèi)參基因能順利擴(kuò)增出來，陰性對(duì)照無擴(kuò)增情況，記錄擴(kuò)增結(jié)果。

用SYBR GreenⅠ熒光嵌合法檢測(cè)，建立qRTPCR方法。首先分析了內(nèi)參基因和轉(zhuǎn)基因的溶解曲線，以檢測(cè)本反應(yīng)體系的特異性[12]。圖1顯示，2個(gè)基因的溶解曲線主峰單一，表明特異性較好，擴(kuò)增條件可靠。

2.2 半定量RT-PCR檢測(cè)不同組織中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平

本實(shí)驗(yàn)所建立的C57-ras癌癥小鼠模型將用于臨床前新藥的致癌性安全評(píng)價(jià)[13-14]，所以我們期望轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras能全身表達(dá)。

選取No.2系8周齡C57-ras小鼠，提取其心、肝、脾、肺、腎、睪丸、胸腺、胃、肌肉、皮膚、淋巴結(jié)、小腸、血液等13個(gè)樣本的總RNA，同時(shí)檢測(cè)GAPDH和轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras的表達(dá)。結(jié)果如圖2，內(nèi)參基因在不同組織中均能穩(wěn)定擴(kuò)增，包括來自野生型的肝組織。轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras在各組織中均有表達(dá)，能大體區(qū)分出在心、肝、脾臟和血液組織中的表達(dá)量較低，而在皮膚、小腸和肺組織中的表達(dá)較強(qiáng)。這表明轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras為全身表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15-16]。其他2個(gè)首建鼠系轉(zhuǎn)基因的組織表達(dá)與No.2類似。

2.3 不同首建鼠系轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras的組織表達(dá)

繼上述半定量RT-PCR分析轉(zhuǎn)基因的組織表達(dá)分布之后，選取No.2、No.3和No.5共3個(gè)系的8周齡小鼠，用熒光定量RT-PCR分析心、肝、脾、肺、腎、睪丸等6個(gè)組織中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，結(jié)果見圖3。該基因在所建立不同系小鼠的6個(gè)組織中均有表達(dá)，但不同組織中的表達(dá)量不同，均表現(xiàn)為在肝臟中表達(dá)相對(duì)較低，而在肺臟中表達(dá)最強(qiáng)。每次實(shí)驗(yàn)均單獨(dú)選取同一個(gè)系動(dòng)物，測(cè)定轉(zhuǎn)基因在其6種組織中的表達(dá)量。分別以心臟組織中的表達(dá)量為參照，計(jì)算各組織中c-Ha-ras基因的相對(duì)表達(dá)量（表2），No.3和No.5系小鼠的肺臟表達(dá)量是心臟的6～7倍，最低的No.2系為3倍，表明該轉(zhuǎn)基因在肺臟中高表達(dá)。ΔΔCT=（CTc-Ha-ras-CTGAPDH）樣本組-（CTc-Ha-ras-CTGAPDH）對(duì)照組，計(jì)算改變倍數(shù)（2-ΔΔCT）得出數(shù)據(jù)。2-ΔΔCT表示目的基因的表達(dá)相對(duì)于內(nèi)參基因的變化倍數(shù)，用這一方法可直接得到目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的含量[9]。

圖1 GAPDH和c-Ha-ras基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖2 GAPDH內(nèi)參基因和人源c-Ha-ras基因半定量RT-PCR反應(yīng)

2.4 不同首建鼠系間轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras的表達(dá)

在轉(zhuǎn)基因研究中往往會(huì)得到多只首建鼠，而由于傳統(tǒng)的制作轉(zhuǎn)基因小鼠的方式?jīng)Q定了轉(zhuǎn)基因在小鼠基因組中為隨機(jī)插入，插入位點(diǎn)會(huì)影響轉(zhuǎn)基因的表型，故須對(duì)獲得的首建鼠進(jìn)行篩選，以選擇更加符合要求的首建鼠用于繁殖建系。本次轉(zhuǎn)基因共獲得6只首建鼠，其中3只成功建系。鑒于本模型的用途，我們希望選擇轉(zhuǎn)基因高表達(dá)的首建鼠系。通過上述分析，我們觀察到在3個(gè)首建鼠系中，轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras在各組織中的表達(dá)差異呈相似特征，即在肺組織中最高，而在肝臟中表達(dá)較低。為了比較不同首建鼠系間轉(zhuǎn)基因的表達(dá)差異，以篩選出表達(dá)最高的首建鼠系，選取3個(gè)首建鼠系中8周齡的C57-ras表達(dá)量最高的肺組織為代表，在相同條件下比較轉(zhuǎn)基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見圖4，No.5系表達(dá)量最高，No.2次之，No.3系最低。

2.5 不同時(shí)期肺組織中轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras的表達(dá)

圖3 不同首建鼠系中轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras在各組織中的表達(dá)量

表2 不同首建鼠系各組織中c-Ha-ras基因的表達(dá)

為了考察轉(zhuǎn)基因在不同時(shí)間的表達(dá)水平差異，選取No.3系中8、12和24周齡轉(zhuǎn)基因小鼠的肺臟組織，采用同樣方法分析轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，結(jié)果見圖5，同一首建鼠系中該基因在組織中的表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間差異，12周齡時(shí)表達(dá)量最高，8和24周齡時(shí)表達(dá)較低。本轉(zhuǎn)基因模型用于新藥臨床前安全評(píng)價(jià)時(shí)，一般在6～8周開始給藥，24周結(jié)束，12周左右為腫瘤發(fā)生發(fā)展時(shí)期[17-18]。故本實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)選擇了上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以期為后續(xù)實(shí)際運(yùn)用提供參考。

3 討論

轉(zhuǎn)基因沉默，即不能正常表達(dá)或表達(dá)量過低，是建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型過程中常見的現(xiàn)象，也是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型建立失敗的重要原因[3,19]。

為了較系統(tǒng)地分析C57-ras癌癥小鼠模型中轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras的表達(dá)譜，我們首先用半定量RTPCR分析了心、肝等13種組織樣品，結(jié)果表明該基因能在小鼠模型中廣譜表達(dá)，符合建立模型的初衷。進(jìn)而采用定量RT-PCR方法，分析了心、肝、脾、肺、腎及睪丸等組織中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)肺臟中表達(dá)最強(qiáng)，肝臟中最弱，在保留的3個(gè)首建鼠系中呈現(xiàn)相似規(guī)律。3個(gè)首建鼠系間的比較表明在No.5中表達(dá)較強(qiáng)。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因能夠高表達(dá)。鑒于No.5首建鼠系表達(dá)最強(qiáng)，可優(yōu)先考慮保留該系，用于大規(guī)模繁殖和建系。由于本實(shí)驗(yàn)所用模型已傳12代，同樣檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因能高表達(dá)，間接表明轉(zhuǎn)基因能穩(wěn)定遺傳。

圖4 不同首建鼠系間肺組織中轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras的表達(dá)差異

圖5 轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras在No.3系首建鼠肺組織中不同時(shí)間的表達(dá)

轉(zhuǎn)基因癌癥小鼠模型是對(duì)臨床前藥物致癌性評(píng)價(jià)很有價(jià)值的研究模型[14]。對(duì)于新藥致癌性的臨床前安全性，傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法是通過2年期大、小鼠致癌性實(shí)驗(yàn)完成的，而轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于致癌性評(píng)價(jià)具有時(shí)間短（6個(gè)月）、費(fèi)用省、結(jié)果可靠、動(dòng)物使用量少（≤50%/組）等特點(diǎn)[8,17]。這也是目前ICH推薦的快速評(píng)價(jià)新藥致癌性的替代方法之一。目前使用較為廣泛的模型有基因敲除模型p53+/-、轉(zhuǎn)基因模型Tg rasH2和XPA+/-等4種[18,20]。雖然國(guó)外已建立這些模型，但由于商業(yè)價(jià)值和知識(shí)產(chǎn)權(quán)限制，國(guó)內(nèi)很難將其用于商業(yè)服務(wù)和法定檢驗(yàn)中。因此，我們不得不自主從頭建立這一模型。

總之，我們通過半定量和熒光定量RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)癌癥動(dòng)物模型C57-ras中轉(zhuǎn)基因能穩(wěn)定地高表達(dá)，這為該模型用于新藥臨床前致癌性安全性評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)。

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