5種不同遺傳背景綠色熒光蛋白(GFP)基因?qū)胂敌∈蟮呐嘤?/h1>
2013-10-28 05:04:19吳培林俞利平尹洪萍楊偉偉顧美兒劉桂杰張艷麗李高天吳寶金
吳培林,俞利平,尹洪萍,楊偉偉,顧美兒,劉桂杰,張艷麗,李高天,吳寶金
(杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,浙江 杭州 310036)
5種不同遺傳背景綠色熒光蛋白(GFP)基因?qū)胂敌∈蟮呐嘤?/p>
吳培林,俞利平,尹洪萍,楊偉偉,顧美兒,劉桂杰,張艷麗,李高天,吳寶金
(杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,浙江 杭州 310036)
通過(guò)反復(fù)回交——篩選目的基因的手段,將C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J轉(zhuǎn)基因小鼠的綠色熒光蛋白基因(GFP)分別向BABL/C、CBA/J、DBA/2J、AKR/J、FVB/J等品系小鼠導(dǎo)入,得到了5種不同遺傳背景且?guī)в蠫FP基因的導(dǎo)入系小鼠.冰凍組織切片等方法顯示GFP導(dǎo)入系小鼠的皮膚、肝、腎、心、肺等均有不同程度的綠色熒光蛋白表達(dá),不同遺傳背景對(duì)GFP的組織表達(dá)譜、血液生理指標(biāo)及繁殖性能未見(jiàn)影響.本實(shí)驗(yàn)采用基因?qū)敕ㄅ嘤?種新的帶有GFP導(dǎo)入系小鼠,這些不同遺傳背景的基因?qū)胂敌∈鬄橐浦采飳W(xué)研究提供了材料.
綠色熒光蛋白;基因?qū)?表達(dá)譜
綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是從水母中提取的能發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì),它無(wú)需作用底物或共作用物,在熒光激發(fā)下可以直接發(fā)光[1-4].GFP性質(zhì)穩(wěn)定,可在多種異源生物中表達(dá)且無(wú)細(xì)胞毒性,作為優(yōu)良的生物示蹤材料被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究.C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J(杰克遜實(shí)驗(yàn)室,The Jackson Lab,的品種編號(hào)為004353)是一種C57BL/6(B6)背景,GFP表達(dá)水平最高及使用最廣泛的轉(zhuǎn)基因小鼠之一,被用于組織細(xì)胞移植方面的研究(http://jaxmice.jax.org/strain/004353.html).由于不同品系小鼠可能具有不同H-2復(fù)合體的遺傳背景,而只有在相同H-2復(fù)合體的近交系小鼠間進(jìn)行器官組織或細(xì)胞系移植,才能最大限度消除免疫系統(tǒng)對(duì)移植的排斥效應(yīng).近交系有約450種[5],常用近交系近10余種,B6背景的GFP小鼠遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足移植生物學(xué)的需求,培育不同H-2復(fù)合體遺傳背景且表達(dá)GFP的小鼠品系非常必要.本實(shí)驗(yàn)以C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J轉(zhuǎn)基因小鼠為基礎(chǔ),通過(guò)反復(fù)向特定品系交配并在后代篩選GFP基因的方法,將GFP基因?qū)雵?guó)內(nèi)常用的近交系小鼠中,培育了5種表達(dá)GFP基因的導(dǎo)入系小鼠.
1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境
C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J小鼠從美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室引進(jìn),DBA/2J、FVB/J、BALB/c、AKR/J、CBA/J 5種近交系小鼠由杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,所有小鼠均為清潔級(jí),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(浙)2011—0048,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(浙)2011—0157.所有小鼠飼養(yǎng)在屏障動(dòng)物房?jī)?nèi),溫度控制在(23±2)℃,濕度控制在(55±5)%,飼料采用Co60照射,自由采食和飲水,定期更換籠具、墊料(均經(jīng)高溫滅菌),室內(nèi)照明采用12/12 h明暗交替.
1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
PCR相關(guān)試劑和引物由上海生物工程有限公司提供;相關(guān)儀器有：德國(guó)MicRom HM550冰凍切片機(jī),NIKON ECLIPSE 80i熒光顯微鏡,美國(guó)HEMAVET 950血常規(guī)分析儀,美國(guó)Caliper IVIS Kinetic小動(dòng)物活體成像系統(tǒng),BIOS1000 PCR儀,TANON EPS300電泳儀,Tamon2500數(shù)顯凝膠成像系統(tǒng)等.
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 GFP導(dǎo)入系小鼠的培育
將C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J純合子小鼠分別與DBA/2J、FVB/J、BALB/c、AKR/J、CBA/J共5種近交系小鼠配種,建立5個(gè)繁殖體系,每一繁殖體系的后代小鼠用PCR結(jié)合紫外光照射方法檢測(cè)是否攜帶GFP基因.選擇GFP陽(yáng)性小鼠繼續(xù)向希望導(dǎo)入的背景品系回交.如此反復(fù)回交10代以上.各繁殖體系在每一代小鼠中均保留6～8對(duì),保證每個(gè)繁殖體系不斷代,培育過(guò)程中,除用于繁殖的個(gè)體,其余小鼠淘汰.
1.2.2 GFP純合子導(dǎo)入系的培養(yǎng)及確認(rèn)
在得到不同近交系背景GFP雜合子小鼠的基礎(chǔ)上,將各繁殖體系的GFP雜合子互交,理論上后代小鼠中有1/4為GFP純合子小鼠.將檢測(cè)對(duì)象再次與背景品系交配繁殖15只以上子代小鼠,若所有子代全部帶GFP基因或表達(dá)GFP,則檢測(cè)對(duì)象為純合子,若后代仔鼠中有一只正常小鼠則淘汰檢測(cè)對(duì)象.選擇純合子互交,保種.
1.2.3 GFP陽(yáng)性小鼠篩選
1.2.3.1 熒光觀察及確認(rèn)
在各個(gè)繁殖體系中,將GFP陽(yáng)性小鼠回交背景品系得到的后代小鼠置于暗室內(nèi),用手提式紫外燈照射或小鼠活體成像儀下拍照觀察有無(wú)綠色熒光的發(fā)生,有綠色熒光的小鼠保留,沒(méi)有發(fā)綠色熒光的小鼠淘汰.發(fā)綠色熒光的小鼠與對(duì)照小鼠分別用CO2麻醉后,置小動(dòng)物活體成像儀于480 nm條件下拍攝.
1.2.3.2 PCR擴(kuò)增確認(rèn)
剪取小鼠尾部組織約0.5 cm,酚氯仿法提取DNA,采用DNAStar軟件設(shè)計(jì)一對(duì)GFP引物：P1:5’-TCATGGCCGACAAGCAGAAGAACG-3’,P2:5’-CGGCGGCGGTCACGAACTC-3’.20 μL反應(yīng)體系,10×buffer2.0 μL,Mg2+(25 mmol/L)1.6 μL,dNTP(10 mmol/L)0.25 μL,上下游引物(50 uΜ/L)各0.25 μL,Taq酶(50 IU)0.25 μL,DNA模板1 μL,加蒸餾水至20 μL.94 ℃5 min預(yù)變性,94 ℃30 s,65 ℃30 s,72 ℃30 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min,16 ℃保存.4%瓊脂糖凝膠電泳,紫外等條件下拍照觀察.
1.2.4 GFP導(dǎo)入系小鼠的表型分析
1.2.4.1 GFP組織表達(dá)檢測(cè)
取GFP導(dǎo)入系5種不同背景的4 W齡純合子小鼠,5%的水合氯醛麻醉后處死,分別取心、肝、肺、皮膚、腦等不同的組織,置于冰凍切片機(jī)急速冷凍后行連續(xù)切片,于熒光顯微鏡下觀察,同時(shí)設(shè)背景品系作為對(duì)照.
1.2.4.2 血常規(guī)檢測(cè)
取4周齡GFP導(dǎo)入系小鼠和相應(yīng)背景小鼠雌雄各8只,眶靜脈采血約200 μL,置于含有K2-EDTA抗凝劑的指形管中顛倒混勻,動(dòng)物血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè).
1.2.4.3 繁殖性能檢測(cè)
各繁殖體系6～8 W齡GFP導(dǎo)入系小鼠1∶1交配各6對(duì),分別記錄各繁殖體系小鼠的產(chǎn)仔數(shù)與胎間隔日期,同時(shí)設(shè)背景品系作為對(duì)照.
2 結(jié) 果
2.1 獲得5種不同遺傳背景的基因?qū)胂敌∈?/p>
本實(shí)驗(yàn)成功將C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J與DBA/2J、FVB/J、BALB/c、AKR/J、CBA/J分別交配,建立了5個(gè)基因?qū)敕敝丑w系.在各繁殖體系的后代中篩選GFP陽(yáng)性小鼠后向同一品系回交,幾種繁殖體系均未出現(xiàn)繁殖中斷現(xiàn)象,經(jīng)10次回交后,獲得5種GFP陽(yáng)性的導(dǎo)入基因雜合子小鼠.隨后將GFP雜合子互交得到帶有GFP基因的純合子小鼠,依據(jù)基因?qū)胂得?guī)則,將5種GFP基因?qū)胂敌∈蠓謩e命名為B6.D2-GFP,B6.CB-GFP,B6.FVB-GFP,B6.C-GFP及B6.AK-GFP(如圖1),這幾種基因?qū)胂敌∈蟮腍-2復(fù)合體類型與各自的背景品系一致,分別為H2d、H2k、H2q、H2d和H2k.將成年鼠和新生鼠在紫外下觀察,可以看到明顯的綠色熒光,在小動(dòng)物成像儀中可清晰分辨出陽(yáng)性GFP小鼠.在自然光源下,白色被毛紅色眼GFP小鼠可看到眼球明顯呈綠色,有色小鼠則無(wú)法分辯.GFP陽(yáng)性小鼠熒光檢測(cè)與PCR檢測(cè)結(jié)果一致,發(fā)綠色熒光的小鼠均可見(jiàn)擴(kuò)增得到250 bp左右的目標(biāo)條帶(如圖2).
A.GFP轉(zhuǎn)基因小鼠在小動(dòng)物成像儀下拍攝圖片;B.B6.D2-GFP;C.B6.CB-GFP;D.B6.FVB-GFP;E.B6.C-GFP;F.B6.AK-GFP.每幅圖片右側(cè)為GFP基因?qū)胄∈?左側(cè)為背景對(duì)照.動(dòng)物成像儀可以顯著區(qū)分陽(yáng)性小鼠,肉眼可見(jiàn)GFP陽(yáng)性白色被毛小鼠眼睛呈淡綠色,無(wú)法分辨有色小鼠GFP是否表達(dá).
注：1、3、5、7、9、11泳道分別為對(duì)應(yīng)的各背景品系小鼠DNA樣本;2、4、6、8、10、12泳道分別為C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J，B6.D2-GFP,B6.CB-GFP,B6.FVB-GFP,B6.C-GFP及B6.AK-GFP小鼠的DNA樣本.
2.2 基因?qū)胂敌∈蟮谋硇吞卣?/p>
2.2.1 組織表達(dá)譜分析
熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),5種基因?qū)胂敌∈驡FP在各種類型組織細(xì)胞中的表達(dá)情況均與親本C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J轉(zhuǎn)基因小鼠一致：GFP在心、肝、肺、腎、表皮、胃腸壁、白細(xì)胞及血小板組織細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng),在皮下組織、腦組織、脂肪細(xì)胞、脈絡(luò)膜及鞏膜內(nèi)面低表達(dá),在紅細(xì)胞幾乎不表達(dá).不僅如此,在肝、脾等組織中,GFP在細(xì)胞間質(zhì)的聚集量顯著高于細(xì)胞內(nèi),而心肌、腎小管等細(xì)胞內(nèi)外GFP含量一致.背景品系對(duì)應(yīng)組織細(xì)胞中無(wú)綠色熒光蛋白的表達(dá)(如圖3).
注：A.血涂片;B.眼球壁;C.耳廓皮膚;D.心肌;E.肝;F.腎;G.腦;H.脾;I.GFP陰性小鼠肝組織.
2.2.2 血常規(guī)結(jié)果分析
經(jīng)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)比較,5種導(dǎo)入系小鼠與背景品系的各項(xiàng)指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(結(jié)果未顯示).顯示GFP基因?qū)π∈蟮难?xì)胞發(fā)育無(wú)顯著影響.
2.2.3 繁殖性能比較
各GFP導(dǎo)入系小鼠與相應(yīng)的背景品系的產(chǎn)仔個(gè)數(shù)(P1)和胎間隔天數(shù)(P2)比較,P值均大于0.05,無(wú)顯著性差異,說(shuō)明GFP基因?qū)π∈蟮姆敝承阅軣o(wú)顯著影響(見(jiàn)表1).
表1 小鼠繁殖學(xué)指標(biāo)對(duì)比
3 討 論
3.1 關(guān)于同源基因?qū)敕?/p>
通過(guò)反復(fù)回交——篩選的基因?qū)敕ㄊ桥嘤齽?dòng)植物新品系的經(jīng)典手段.Snell利用這一方法將一種近交系小鼠中的腫瘤抗性基因?qū)肓硪灰赘心[瘤的近交系小鼠中,使后者獲得腫瘤抗性,并借此發(fā)現(xiàn)了小鼠的主要組織相容性抗原(major histocompatibility antigen,MHC)即H-2系統(tǒng)[6].通過(guò)基因?qū)肱嘤慕幌当环Q為同源導(dǎo)入近交系(congenic inbred strain),通常指2個(gè)以上品系之間有少部分基因不同而其它基因都相同的近交系小鼠.采用這一方法,將同一基因?qū)氩煌z傳背景,以比較同一基因在不同遺傳背景中的功能差異;可以將某基因不同的等位基因?qū)胍粋€(gè)相同的遺傳背景中,比較不同等位基因在相同遺傳背景下的不同效應(yīng);也可以將封閉群中發(fā)現(xiàn)的突變表型導(dǎo)入近交系,純化特定基因的遺傳背景,繼而方便對(duì)突變基因的定位鑒定[7-8].
李振林等[9]用顯微注射的方法建立新生血管的內(nèi)皮中有綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠,徐藝玫等[10]通過(guò)精子載體法將GFP基因?qū)隟M小鼠體內(nèi),這些實(shí)驗(yàn)方法雖然都取得了成功,但實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較復(fù)雜繁瑣,技術(shù)要求較高.相對(duì)于轉(zhuǎn)基因及基因敲除等遺傳工程手段,基因?qū)敕ú僮骷凹夹g(shù)要求簡(jiǎn)單,研究者針對(duì)感興趣的表型或特定的染色體片段,在普通實(shí)驗(yàn)室就可以開(kāi)展相關(guān)工作,實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠,其缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng).本文采用基因?qū)敕?經(jīng)過(guò)近3年的工作,最終成功培育了B6.D2-GFP,B6.CB-GFP,B6.FVB-GFP,B6.C-GFP及B6.AK-GFP近交系背景共5種GFP基因?qū)胂敌∈?不同于B6小鼠的H2b,這些小鼠的MHC類型分別是：H2d、H2k、H2q、H2d和H2k.
3.2 GFP導(dǎo)入系小鼠的生物學(xué)特征
本實(shí)驗(yàn)培育的5種GFP基因?qū)胂敌∈?其GFP表達(dá)水平與親本小鼠沒(méi)有差別,器官組織的表達(dá)譜一致,且對(duì)血液生理及生殖能力均無(wú)明顯影響,說(shuō)明遺傳背景差異不影響GFP表達(dá),且GFP對(duì)小鼠無(wú)顯著毒副作用.通過(guò)對(duì)GFP導(dǎo)入系小鼠的表型分析,我們認(rèn)為兩個(gè)問(wèn)題值得注意:一是各種組織中的表達(dá)量有顯著差異,只有較高表達(dá)水平的組織細(xì)胞才適合作為移植供體使用;二是在部分組織細(xì)胞內(nèi),如肝臟、脾等,GFP表達(dá)后被輸送到細(xì)胞間質(zhì),細(xì)胞內(nèi)GFP含量相對(duì)較少,這在移植實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該給予足夠重視.對(duì)這些導(dǎo)入系小鼠而言,深入開(kāi)展組織細(xì)胞表達(dá)譜的工作非常重要,可以為移植生物學(xué)供體選擇提供更多信息.
3.3 GFP導(dǎo)入系小鼠的應(yīng)用價(jià)值
表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠是熒光成像系統(tǒng)的重要?jiǎng)游锬Ｐ?為干細(xì)胞的分化與定位、免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用等移植生物學(xué)研究提供了有力的工具動(dòng)物和影像學(xué)技術(shù)手段[11].全世界現(xiàn)有近交系小鼠450多種[5],其中常用品系約10余種,盡管表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠有很多,但他們的背景品系僅有C57BL/6J、129、STOCK等少數(shù)幾種(http://jaxmice.jax.org/strain/004353.html).由于不同近交系小鼠間H-2復(fù)合體差異性的限制,GFP供體小鼠的缺乏在一定程度上影響著移植生物學(xué)的發(fā)展.比如魯文果[12]曾經(jīng)在不同品種動(dòng)物間進(jìn)行細(xì)胞移植的嘗試,因供體組織與受體動(dòng)物主要組織相容性抗原不同,供體組織細(xì)胞的發(fā)育與遷徙必然受到很大影響.本實(shí)驗(yàn)培育的5種GFP基因?qū)胂敌∈?是以國(guó)內(nèi)外常用近交系小鼠為背景自主培育的,為移植供體提供了更多的選擇余地.另一方面,C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J轉(zhuǎn)GFP基因小鼠是從美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)的,按照引進(jìn)協(xié)議,這種小鼠只能被用于純粹的科學(xué)研究,禁止用于商業(yè)目的的開(kāi)發(fā).本實(shí)驗(yàn)培育的5種GFP基因?qū)胂敌∈蟊荛_(kāi)了從國(guó)外引進(jìn)小鼠帶來(lái)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)問(wèn)題,對(duì)移植生物學(xué)研究也具有重要的意義.
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BreedingFiveKindsofCongenicMicewiththeGreenFluorescentProteinGene
WU Peilin, YU Liping, YIN Hongping,YANG Weiwei, GU Meier,LIU Guijie, ZHANG Yanli, LI Gaotian, WU Baojin
(Laboratory of Experimental Animal Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)
Using the method of repeated backcrossing and screening target gene, the experiment introduced the green fluorescent protein (GFP) gene of C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J mouse into five different inbred strains including BABL/C, CBA/J, DBA/2J, AKR/J, and FVB/J respectively, and finally obtained B6.D2-GFP, B6.CB-GFP, B6.FVB-GFP,B6.C-GFP and B6.AK-GFP congenic mice with the GFP gene. Frozen tissue sections showed that GFP was, in different degree, expressed in tissues like skin, liver, kidney, heart and lung, etc. Different genetic background had no effect on the expression profile of GFP, the blood physiological parameter and reproductive performance. Five kinds of congenic mice with GFP bred in this experiment provide donor materials for the researches of transplantation biology.
green fluorescent protein(GFP); congenic mouse; expression profile
2012-10-15
杭州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(20100333T06);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071092);浙江省衛(wèi)生廳科技項(xiàng)目(2009A160).
吳寶金(1969—),男,教授,博士,主要從事人類疾病小鼠模型及分子遺傳學(xué)研究.E-mail: baojinwu@163.com
10.3969/j.issn.1674-232X.2013.01.002
Q95-33
A
1674-232X(2013)01-0008-06
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吳培林,俞利平,尹洪萍,楊偉偉,顧美兒,劉桂杰,張艷麗,李高天,吳寶金
(杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,浙江 杭州 310036)
5種不同遺傳背景綠色熒光蛋白(GFP)基因?qū)胂敌∈蟮呐嘤?/p>
吳培林,俞利平,尹洪萍,楊偉偉,顧美兒,劉桂杰,張艷麗,李高天,吳寶金
(杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,浙江 杭州 310036)
通過(guò)反復(fù)回交——篩選目的基因的手段,將C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J轉(zhuǎn)基因小鼠的綠色熒光蛋白基因(GFP)分別向BABL/C、CBA/J、DBA/2J、AKR/J、FVB/J等品系小鼠導(dǎo)入,得到了5種不同遺傳背景且?guī)в蠫FP基因的導(dǎo)入系小鼠.冰凍組織切片等方法顯示GFP導(dǎo)入系小鼠的皮膚、肝、腎、心、肺等均有不同程度的綠色熒光蛋白表達(dá),不同遺傳背景對(duì)GFP的組織表達(dá)譜、血液生理指標(biāo)及繁殖性能未見(jiàn)影響.本實(shí)驗(yàn)采用基因?qū)敕ㄅ嘤?種新的帶有GFP導(dǎo)入系小鼠,這些不同遺傳背景的基因?qū)胂敌∈鬄橐浦采飳W(xué)研究提供了材料.
綠色熒光蛋白;基因?qū)?表達(dá)譜
綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是從水母中提取的能發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì),它無(wú)需作用底物或共作用物,在熒光激發(fā)下可以直接發(fā)光[1-4].GFP性質(zhì)穩(wěn)定,可在多種異源生物中表達(dá)且無(wú)細(xì)胞毒性,作為優(yōu)良的生物示蹤材料被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究.C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J(杰克遜實(shí)驗(yàn)室,The Jackson Lab,的品種編號(hào)為004353)是一種C57BL/6(B6)背景,GFP表達(dá)水平最高及使用最廣泛的轉(zhuǎn)基因小鼠之一,被用于組織細(xì)胞移植方面的研究(http://jaxmice.jax.org/strain/004353.html).由于不同品系小鼠可能具有不同H-2復(fù)合體的遺傳背景,而只有在相同H-2復(fù)合體的近交系小鼠間進(jìn)行器官組織或細(xì)胞系移植,才能最大限度消除免疫系統(tǒng)對(duì)移植的排斥效應(yīng).近交系有約450種[5],常用近交系近10余種,B6背景的GFP小鼠遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足移植生物學(xué)的需求,培育不同H-2復(fù)合體遺傳背景且表達(dá)GFP的小鼠品系非常必要.本實(shí)驗(yàn)以C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J轉(zhuǎn)基因小鼠為基礎(chǔ),通過(guò)反復(fù)向特定品系交配并在后代篩選GFP基因的方法,將GFP基因?qū)雵?guó)內(nèi)常用的近交系小鼠中,培育了5種表達(dá)GFP基因的導(dǎo)入系小鼠.
1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境
C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J小鼠從美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室引進(jìn),DBA/2J、FVB/J、BALB/c、AKR/J、CBA/J 5種近交系小鼠由杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,所有小鼠均為清潔級(jí),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(浙)2011—0048,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(浙)2011—0157.所有小鼠飼養(yǎng)在屏障動(dòng)物房?jī)?nèi),溫度控制在(23±2)℃,濕度控制在(55±5)%,飼料采用Co60照射,自由采食和飲水,定期更換籠具、墊料(均經(jīng)高溫滅菌),室內(nèi)照明采用12/12 h明暗交替.
1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
PCR相關(guān)試劑和引物由上海生物工程有限公司提供;相關(guān)儀器有：德國(guó)MicRom HM550冰凍切片機(jī),NIKON ECLIPSE 80i熒光顯微鏡,美國(guó)HEMAVET 950血常規(guī)分析儀,美國(guó)Caliper IVIS Kinetic小動(dòng)物活體成像系統(tǒng),BIOS1000 PCR儀,TANON EPS300電泳儀,Tamon2500數(shù)顯凝膠成像系統(tǒng)等.
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 GFP導(dǎo)入系小鼠的培育
將C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J純合子小鼠分別與DBA/2J、FVB/J、BALB/c、AKR/J、CBA/J共5種近交系小鼠配種,建立5個(gè)繁殖體系,每一繁殖體系的后代小鼠用PCR結(jié)合紫外光照射方法檢測(cè)是否攜帶GFP基因.選擇GFP陽(yáng)性小鼠繼續(xù)向希望導(dǎo)入的背景品系回交.如此反復(fù)回交10代以上.各繁殖體系在每一代小鼠中均保留6～8對(duì),保證每個(gè)繁殖體系不斷代,培育過(guò)程中,除用于繁殖的個(gè)體,其余小鼠淘汰.
1.2.2 GFP純合子導(dǎo)入系的培養(yǎng)及確認(rèn)
在得到不同近交系背景GFP雜合子小鼠的基礎(chǔ)上,將各繁殖體系的GFP雜合子互交,理論上后代小鼠中有1/4為GFP純合子小鼠.將檢測(cè)對(duì)象再次與背景品系交配繁殖15只以上子代小鼠,若所有子代全部帶GFP基因或表達(dá)GFP,則檢測(cè)對(duì)象為純合子,若后代仔鼠中有一只正常小鼠則淘汰檢測(cè)對(duì)象.選擇純合子互交,保種.
1.2.3 GFP陽(yáng)性小鼠篩選
1.2.3.1 熒光觀察及確認(rèn)
在各個(gè)繁殖體系中,將GFP陽(yáng)性小鼠回交背景品系得到的后代小鼠置于暗室內(nèi),用手提式紫外燈照射或小鼠活體成像儀下拍照觀察有無(wú)綠色熒光的發(fā)生,有綠色熒光的小鼠保留,沒(méi)有發(fā)綠色熒光的小鼠淘汰.發(fā)綠色熒光的小鼠與對(duì)照小鼠分別用CO2麻醉后,置小動(dòng)物活體成像儀于480 nm條件下拍攝.
1.2.3.2 PCR擴(kuò)增確認(rèn)
剪取小鼠尾部組織約0.5 cm,酚氯仿法提取DNA,采用DNAStar軟件設(shè)計(jì)一對(duì)GFP引物：P1:5’-TCATGGCCGACAAGCAGAAGAACG-3’,P2:5’-CGGCGGCGGTCACGAACTC-3’.20 μL反應(yīng)體系,10×buffer2.0 μL,Mg2+(25 mmol/L)1.6 μL,dNTP(10 mmol/L)0.25 μL,上下游引物(50 uΜ/L)各0.25 μL,Taq酶(50 IU)0.25 μL,DNA模板1 μL,加蒸餾水至20 μL.94 ℃5 min預(yù)變性,94 ℃30 s,65 ℃30 s,72 ℃30 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min,16 ℃保存.4%瓊脂糖凝膠電泳,紫外等條件下拍照觀察.
1.2.4 GFP導(dǎo)入系小鼠的表型分析
1.2.4.1 GFP組織表達(dá)檢測(cè)
取GFP導(dǎo)入系5種不同背景的4 W齡純合子小鼠,5%的水合氯醛麻醉后處死,分別取心、肝、肺、皮膚、腦等不同的組織,置于冰凍切片機(jī)急速冷凍后行連續(xù)切片,于熒光顯微鏡下觀察,同時(shí)設(shè)背景品系作為對(duì)照.
1.2.4.2 血常規(guī)檢測(cè)
取4周齡GFP導(dǎo)入系小鼠和相應(yīng)背景小鼠雌雄各8只,眶靜脈采血約200 μL,置于含有K2-EDTA抗凝劑的指形管中顛倒混勻,動(dòng)物血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè).
1.2.4.3 繁殖性能檢測(cè)
各繁殖體系6～8 W齡GFP導(dǎo)入系小鼠1∶1交配各6對(duì),分別記錄各繁殖體系小鼠的產(chǎn)仔數(shù)與胎間隔日期,同時(shí)設(shè)背景品系作為對(duì)照.
2 結(jié) 果
2.1 獲得5種不同遺傳背景的基因?qū)胂敌∈?/p>
本實(shí)驗(yàn)成功將C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J與DBA/2J、FVB/J、BALB/c、AKR/J、CBA/J分別交配,建立了5個(gè)基因?qū)敕敝丑w系.在各繁殖體系的后代中篩選GFP陽(yáng)性小鼠后向同一品系回交,幾種繁殖體系均未出現(xiàn)繁殖中斷現(xiàn)象,經(jīng)10次回交后,獲得5種GFP陽(yáng)性的導(dǎo)入基因雜合子小鼠.隨后將GFP雜合子互交得到帶有GFP基因的純合子小鼠,依據(jù)基因?qū)胂得?guī)則,將5種GFP基因?qū)胂敌∈蠓謩e命名為B6.D2-GFP,B6.CB-GFP,B6.FVB-GFP,B6.C-GFP及B6.AK-GFP(如圖1),這幾種基因?qū)胂敌∈蟮腍-2復(fù)合體類型與各自的背景品系一致,分別為H2d、H2k、H2q、H2d和H2k.將成年鼠和新生鼠在紫外下觀察,可以看到明顯的綠色熒光,在小動(dòng)物成像儀中可清晰分辨出陽(yáng)性GFP小鼠.在自然光源下,白色被毛紅色眼GFP小鼠可看到眼球明顯呈綠色,有色小鼠則無(wú)法分辯.GFP陽(yáng)性小鼠熒光檢測(cè)與PCR檢測(cè)結(jié)果一致,發(fā)綠色熒光的小鼠均可見(jiàn)擴(kuò)增得到250 bp左右的目標(biāo)條帶(如圖2).
A.GFP轉(zhuǎn)基因小鼠在小動(dòng)物成像儀下拍攝圖片;B.B6.D2-GFP;C.B6.CB-GFP;D.B6.FVB-GFP;E.B6.C-GFP;F.B6.AK-GFP.每幅圖片右側(cè)為GFP基因?qū)胄∈?左側(cè)為背景對(duì)照.動(dòng)物成像儀可以顯著區(qū)分陽(yáng)性小鼠,肉眼可見(jiàn)GFP陽(yáng)性白色被毛小鼠眼睛呈淡綠色,無(wú)法分辨有色小鼠GFP是否表達(dá).
注：1、3、5、7、9、11泳道分別為對(duì)應(yīng)的各背景品系小鼠DNA樣本;2、4、6、8、10、12泳道分別為C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J，B6.D2-GFP,B6.CB-GFP,B6.FVB-GFP,B6.C-GFP及B6.AK-GFP小鼠的DNA樣本.
2.2 基因?qū)胂敌∈蟮谋硇吞卣?/p>
2.2.1 組織表達(dá)譜分析
熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),5種基因?qū)胂敌∈驡FP在各種類型組織細(xì)胞中的表達(dá)情況均與親本C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J轉(zhuǎn)基因小鼠一致：GFP在心、肝、肺、腎、表皮、胃腸壁、白細(xì)胞及血小板組織細(xì)胞中表達(dá)較強(qiáng),在皮下組織、腦組織、脂肪細(xì)胞、脈絡(luò)膜及鞏膜內(nèi)面低表達(dá),在紅細(xì)胞幾乎不表達(dá).不僅如此,在肝、脾等組織中,GFP在細(xì)胞間質(zhì)的聚集量顯著高于細(xì)胞內(nèi),而心肌、腎小管等細(xì)胞內(nèi)外GFP含量一致.背景品系對(duì)應(yīng)組織細(xì)胞中無(wú)綠色熒光蛋白的表達(dá)(如圖3).
注：A.血涂片;B.眼球壁;C.耳廓皮膚;D.心肌;E.肝;F.腎;G.腦;H.脾;I.GFP陰性小鼠肝組織.
2.2.2 血常規(guī)結(jié)果分析
經(jīng)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)比較,5種導(dǎo)入系小鼠與背景品系的各項(xiàng)指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(結(jié)果未顯示).顯示GFP基因?qū)π∈蟮难?xì)胞發(fā)育無(wú)顯著影響.
2.2.3 繁殖性能比較
各GFP導(dǎo)入系小鼠與相應(yīng)的背景品系的產(chǎn)仔個(gè)數(shù)(P1)和胎間隔天數(shù)(P2)比較,P值均大于0.05,無(wú)顯著性差異,說(shuō)明GFP基因?qū)π∈蟮姆敝承阅軣o(wú)顯著影響(見(jiàn)表1).
表1 小鼠繁殖學(xué)指標(biāo)對(duì)比
3 討 論
3.1 關(guān)于同源基因?qū)敕?/p>
通過(guò)反復(fù)回交——篩選的基因?qū)敕ㄊ桥嘤齽?dòng)植物新品系的經(jīng)典手段.Snell利用這一方法將一種近交系小鼠中的腫瘤抗性基因?qū)肓硪灰赘心[瘤的近交系小鼠中,使后者獲得腫瘤抗性,并借此發(fā)現(xiàn)了小鼠的主要組織相容性抗原(major histocompatibility antigen,MHC)即H-2系統(tǒng)[6].通過(guò)基因?qū)肱嘤慕幌当环Q為同源導(dǎo)入近交系(congenic inbred strain),通常指2個(gè)以上品系之間有少部分基因不同而其它基因都相同的近交系小鼠.采用這一方法,將同一基因?qū)氩煌z傳背景,以比較同一基因在不同遺傳背景中的功能差異;可以將某基因不同的等位基因?qū)胍粋€(gè)相同的遺傳背景中,比較不同等位基因在相同遺傳背景下的不同效應(yīng);也可以將封閉群中發(fā)現(xiàn)的突變表型導(dǎo)入近交系,純化特定基因的遺傳背景,繼而方便對(duì)突變基因的定位鑒定[7-8].
李振林等[9]用顯微注射的方法建立新生血管的內(nèi)皮中有綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠,徐藝玫等[10]通過(guò)精子載體法將GFP基因?qū)隟M小鼠體內(nèi),這些實(shí)驗(yàn)方法雖然都取得了成功,但實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較復(fù)雜繁瑣,技術(shù)要求較高.相對(duì)于轉(zhuǎn)基因及基因敲除等遺傳工程手段,基因?qū)敕ú僮骷凹夹g(shù)要求簡(jiǎn)單,研究者針對(duì)感興趣的表型或特定的染色體片段,在普通實(shí)驗(yàn)室就可以開(kāi)展相關(guān)工作,實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠,其缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng).本文采用基因?qū)敕?經(jīng)過(guò)近3年的工作,最終成功培育了B6.D2-GFP,B6.CB-GFP,B6.FVB-GFP,B6.C-GFP及B6.AK-GFP近交系背景共5種GFP基因?qū)胂敌∈?不同于B6小鼠的H2b,這些小鼠的MHC類型分別是：H2d、H2k、H2q、H2d和H2k.
3.2 GFP導(dǎo)入系小鼠的生物學(xué)特征
本實(shí)驗(yàn)培育的5種GFP基因?qū)胂敌∈?其GFP表達(dá)水平與親本小鼠沒(méi)有差別,器官組織的表達(dá)譜一致,且對(duì)血液生理及生殖能力均無(wú)明顯影響,說(shuō)明遺傳背景差異不影響GFP表達(dá),且GFP對(duì)小鼠無(wú)顯著毒副作用.通過(guò)對(duì)GFP導(dǎo)入系小鼠的表型分析,我們認(rèn)為兩個(gè)問(wèn)題值得注意:一是各種組織中的表達(dá)量有顯著差異,只有較高表達(dá)水平的組織細(xì)胞才適合作為移植供體使用;二是在部分組織細(xì)胞內(nèi),如肝臟、脾等,GFP表達(dá)后被輸送到細(xì)胞間質(zhì),細(xì)胞內(nèi)GFP含量相對(duì)較少,這在移植實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該給予足夠重視.對(duì)這些導(dǎo)入系小鼠而言,深入開(kāi)展組織細(xì)胞表達(dá)譜的工作非常重要,可以為移植生物學(xué)供體選擇提供更多信息.
3.3 GFP導(dǎo)入系小鼠的應(yīng)用價(jià)值
表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠是熒光成像系統(tǒng)的重要?jiǎng)游锬Ｐ?為干細(xì)胞的分化與定位、免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用等移植生物學(xué)研究提供了有力的工具動(dòng)物和影像學(xué)技術(shù)手段[11].全世界現(xiàn)有近交系小鼠450多種[5],其中常用品系約10余種,盡管表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠有很多,但他們的背景品系僅有C57BL/6J、129、STOCK等少數(shù)幾種(http://jaxmice.jax.org/strain/004353.html).由于不同近交系小鼠間H-2復(fù)合體差異性的限制,GFP供體小鼠的缺乏在一定程度上影響著移植生物學(xué)的發(fā)展.比如魯文果[12]曾經(jīng)在不同品種動(dòng)物間進(jìn)行細(xì)胞移植的嘗試,因供體組織與受體動(dòng)物主要組織相容性抗原不同,供體組織細(xì)胞的發(fā)育與遷徙必然受到很大影響.本實(shí)驗(yàn)培育的5種GFP基因?qū)胂敌∈?是以國(guó)內(nèi)外常用近交系小鼠為背景自主培育的,為移植供體提供了更多的選擇余地.另一方面,C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J轉(zhuǎn)GFP基因小鼠是從美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)的,按照引進(jìn)協(xié)議,這種小鼠只能被用于純粹的科學(xué)研究,禁止用于商業(yè)目的的開(kāi)發(fā).本實(shí)驗(yàn)培育的5種GFP基因?qū)胂敌∈蟊荛_(kāi)了從國(guó)外引進(jìn)小鼠帶來(lái)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)問(wèn)題,對(duì)移植生物學(xué)研究也具有重要的意義.
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BreedingFiveKindsofCongenicMicewiththeGreenFluorescentProteinGene
WU Peilin, YU Liping, YIN Hongping,YANG Weiwei, GU Meier,LIU Guijie, ZHANG Yanli, LI Gaotian, WU Baojin
(Laboratory of Experimental Animal Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)
Using the method of repeated backcrossing and screening target gene, the experiment introduced the green fluorescent protein (GFP) gene of C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J mouse into five different inbred strains including BABL/C, CBA/J, DBA/2J, AKR/J, and FVB/J respectively, and finally obtained B6.D2-GFP, B6.CB-GFP, B6.FVB-GFP,B6.C-GFP and B6.AK-GFP congenic mice with the GFP gene. Frozen tissue sections showed that GFP was, in different degree, expressed in tissues like skin, liver, kidney, heart and lung, etc. Different genetic background had no effect on the expression profile of GFP, the blood physiological parameter and reproductive performance. Five kinds of congenic mice with GFP bred in this experiment provide donor materials for the researches of transplantation biology.
green fluorescent protein(GFP); congenic mouse; expression profile
2012-10-15
杭州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(20100333T06);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071092);浙江省衛(wèi)生廳科技項(xiàng)目(2009A160).
吳寶金(1969—),男,教授,博士,主要從事人類疾病小鼠模型及分子遺傳學(xué)研究.E-mail: baojinwu@163.com
10.3969/j.issn.1674-232X.2013.01.002
Q95-33
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1674-232X(2013)01-0008-06
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