黃巧珍，榮 俊，匡紅艷，蔡聯(lián)燊 (長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

雞傳染性法氏囊病與巴氏桿菌病二價活載體疫苗的免疫原性及免疫效力研究

黃巧珍，榮 俊，匡紅艷，蔡聯(lián)燊 (長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

將實驗工程菌經(jīng)體外表達并檢測其免疫原性后，分別添加殼聚糖和明膠佐劑制備成不同的劑型疫苗，采用局部肌肉注射、灌胃、滴鼻免疫實驗用SPF雞，檢測了自制的一種多殺性巴氏桿菌病和傳染性法氏囊病的二價活菌載體疫苗的免疫效力。結果顯示：(1)工程菌體外表達可用瓊脂雙向免疫擴散實驗(AGP)檢測到IBDV抗原。(2)不同途徑免疫后用AGP檢測抗IBDV抗體，注射組檢出率最高，最高時達90%；明膠佐劑口服免疫組其次，最高時達80%?？贵w檢出率最高的時間是免疫后的第4至5周。(3)IBDV抗體的ELISA檢測結果，無樣本達到試劑盒規(guī)定的陽性標準，但其D650nm的變化規(guī)律與AGP相似。(4)PM抗體的ELISA檢測結果，只有注射組在免疫后6周達到陽性標準，D650nm的變化規(guī)律顯示殼聚糖佐劑和明膠佐劑口服組較好。該結果表明，該二價活載體疫苗體液免疫的效果是確實的，但抗體水平不高。

多殺性巴氏桿菌(PM)；傳染性法氏囊病(IBDV)；VP2表達；活載體疫苗；免疫試驗

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella Multocida，PM)是巴氏桿菌病(Pasteurella Multocida Disease，PMD)的病原體，能感染包括豬、牛、雞在內的多種動物，引起嚴重疾病，如禽霍亂、牛出血性敗血癥、豬萎蔫性鼻炎，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失[1]。傳統(tǒng)的防治巴氏桿菌病(PMD)的方法是給易感動物服用注射高免血清或減毒菌苗，由于其效能單一，難于滿足市場要求。傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由雙鏈RNA病毒科的傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)所引起的一種雞的急性暴發(fā)性傳染病[2-3]，表現(xiàn)為中樞免疫器官法氏囊的淋巴細胞壞死，發(fā)病率及死亡率均較高。目前使用較多的IBD活疫苗，這是一種未完全減毒的中等毒力活疫苗，其主要目的是提供足夠強的免疫刺激以產生對機體保護作用，但中等毒力活疫苗對雞的毒性較大，會造成免疫雞的輕度感染和免疫抑制，影響雞的生長和對其它病原的易感性提高。PMD和IBD的防治對我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展有重要意義。近年來由于基因克隆和重組技術的日益完善和實用化，許多實驗性重組IBD疫苗研發(fā)問世，這些疫苗多以病(毒為活載體，例如1995年報道的Darteil等在實驗室條件下

成功構建的能表達IBDV VP2抗原的重組火雞疤疹病毒HTV活疫苗[4]，由于PM能被動物機體的免疫細胞吞噬，具有良好的抗原呈遞性能，使其有望成為活菌載體疫苗，重組IBD疫苗與PM組合成二價活苗有潛在的可能性。為此，本研究探討了自制的一種雞傳染性法氏囊病與巴氏桿菌病二價活載體疫苗的免疫原性，并采用局部肌肉注射、灌胃、滴鼻免疫實驗用SPF雞，通過雙向瓊脂免疫擴散實驗(AGP)和ELISA抗體檢測這種二價活菌載體疫苗的免疫效力，以期為制備雞傳染性法氏囊病與巴氏桿菌病二價活載體疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

試驗所用菌株PM R473/ EPSPBAKR-pucR-PRPL-VP2由長江大學生命科學學院分子生物實驗室以PM R473 菌株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)加載一個巴氏桿菌-大腸桿菌穿梭表達質粒構建而成。

1.1.2 試驗動物

試驗所用2周齡SPF雞由青島易邦生物技術有限公司實驗動物中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基和主要試劑

腦心浸出汁肉湯(Brain Heart Infusion，BHI)培養(yǎng)基為美國BD (Becton Dickinson)公司產品，稱取BHI培養(yǎng)基37g，溶于1L ddH2O中，滅菌備用；IBDV陽性抗血清、IBD瓊擴抗原購于哈爾濱獸醫(yī)研究所； IBDV抗體ELISA檢測試劑盒、PM抗體ELISA檢測試劑盒為美國IDEXX公司產品；殼聚糖購于浙江澳興生物有限公司；明膠為沈陽市光蘭化工貿易有限公司產品，分析純級；pH7.3的0.01mol/L PBS溶液自制。

1.2 方法

1.2.1 體外表達實驗

將本實驗室構建的質粒EPSPBAKR-pucR-PRPL-VP2電轉化至PMR473感受態(tài)細胞中，構建成表達工程菌。電轉化方法參考文獻[5]。先29℃擴大培養(yǎng)至穩(wěn)定期(D600nm=0.8～1.2)，然后升溫至42℃ 6h誘導表達。轉化菌通過VP2基因的PCR實驗進行鑒定，瓊脂雙向免疫擴散實驗檢測表達產物的免疫原性。

1.2.2 巴氏桿菌-雞傳染性法氏囊病毒二價活載體疫苗的制備

將PM R473/ EPSPBAKR-pucR-PRPL-VP2接種于含卡那霉素50μg/ml的1L BHI培養(yǎng)液搖瓶中200r/min的搖床上29℃過夜培養(yǎng)，于次日按10ml/管收菌，約0.05g(濕菌)/管。

(1)無佐劑活載體疫苗制備 每支取活菌約0.05g，用2ml無菌生理鹽水混勻稀釋。

(2)殼聚糖佐劑活載體疫苗的制備 90%脫乙酰度殼聚糖與生理鹽水配成10%的溶液，再經(jīng)超聲波(12W)處理2次，每次5min，間隔1min。以600r/min離心10min后取上清，并以400目網(wǎng)篩過濾，再以12000r/min離心10min后收集其沉淀物制成殼聚糖小顆粒。將其按3%的比例溶解于0.8%稀乙酸鹽水中即成殼聚糖酸溶液[6]，灌胃途徑疫苗為0.05g活菌用2ml無菌的殼聚糖酸溶液稀釋混勻，滴鼻途徑則取1ml無菌的殼聚糖酸溶液將0.05g活菌稀釋混勻，此即殼聚糖佐劑活載體疫苗。

(3)明膠佐劑活載體疫苗制備 取55℃左右40%的明膠水溶液2ml、預熱的植物油10ml與10ml收菌約0.05g的巴氏桿菌混合后用超聲波(12W)乳化3min，然后在冰水浴中電磁攪拌10min，形成微球后加入10ml異丙醇，繼續(xù)攪拌5min，取出后置室溫30min，吸干析出的油滴，再用異丙醇洗滌至無油滴為止，加入適量10%甲醛異丙醇固化過夜，去上清后用凍干機干燥。將制好的微球經(jīng)懸于磷酸緩沖液2mlPBS中，即得1支明膠佐劑活載體疫苗[7]。

1.2.3 SPF雞免疫試驗

2周齡SPF雞6組，每組10只。免疫前采血液樣本檢測抗體水平作為對照比較免疫結果。按不同佐劑和免疫途徑分6組進行活載體疫苗免疫試驗(表1)。

表1 SPF雞免疫試驗

1.2.4 血清性抗體檢測

2 結果與分析

2.1 重組質粒的PCR鑒定和體外表達VP2抗原瓊脂擴散免疫檢測

對插入了VP2基因的表達載體的工程菌進行PCR鑒定，可擴增出VP2基因約1400bp，而無VP2基因的表達載體插入的PMR473菌液擴增無該特異條帶(圖1A)。PMR473/EPSPBAKR-pucR-PRPL-VP2菌株的誘導表達產物上清采用IBDV VP2抗原瓊脂擴散免疫檢測，結果表明插入了重組質粒的PMR473表達產物有IBDV VP2蛋白抗原的免疫原性，而無VP2基因的表達載體插入的PMR473表達產物不具VP2蛋白抗原的免疫原性(圖1B)。以上結果表明穿梭質粒上的VP2 基因表達了目的蛋白，并且具備IBDV VP2蛋白抗原的免疫原性。

1：陽性質粒；2：陰性對照；3：轉化菌；M：DL marker 8000 0：IBDV陽性抗血清；1：IBDV瓊擴抗原；2：表達上清產物；3：表達上清1/2稀釋液；4：破碎全菌液；5：60%硫酸銨沉上清產物；6：陰性對照 A.VP2基因PCR結果 B：表達產物VP2抗原瓊擴圖

2.2 不同免疫途徑的IBDV抗體瓊脂免疫擴散檢測

表2為不同途徑免疫后不同時間段的IBDV瓊脂擴散檢測統(tǒng)計結果。由表2可見，該工程菌制備的活載體疫苗均可誘導SPF雞產生抗IBDV的抗體。其中1組注射免疫明顯效力最好，檢出率最高，最高時達90%。2、3組佐劑灌胃比4組無佐劑灌胃的SPF雞抗體陽性檢出率高，相比之下第3組明膠佐劑抗體陽性檢出率較高，最高時達80%，2種途徑抗體檢出率最高的時間是免疫后的第4～5周。說明佐劑對于疫苗免疫過程中的抗原呈遞有一定作用，并且明膠比殼聚糖佐劑更耐胃酸，表現(xiàn)的免疫效力稍好；另外對照2組殼聚糖佐劑灌胃組，滴鼻免疫途徑短期也有顯著效果，在免疫后5周達到最高陽性率，表明了雖然滴鼻途徑疫苗在對鼻腔粘膜刺激時間較短，但大劑量、多次滴鼻免疫較灌胃能更好的刺激SPF雞抗法氏囊病病毒的免疫反應。

表2 不同時間段的血清IBDV抗體瓊擴檢測陽性率統(tǒng)計

2.3 不同免疫途徑的IBDV抗體ELISA檢測

經(jīng)IDEXX IBDV抗體檢測試劑盒檢測，所有SPF雞血清樣本S/P<0.2，全判定為陰性(表3)。從表3可看出，較接近抗體IgG陽性水平的有1組注射途徑的第7周和3組明膠佐劑灌胃途徑的第4周，雖然IBDV抗體的ELISA檢測水平很低，但D650nm值的變化規(guī)律與AGP檢測相似，注射途徑是其中效果最顯著的(P<0.01)；灌胃途徑中明膠佐劑組最優(yōu)(3組P<0.01)；殼聚糖佐劑組滴鼻途徑第3周抗體IgG水平最高，但在第7周2種佐劑灌胃途徑抗體IgG水平高于滴鼻途徑，說明滴鼻途徑免疫短時間效果良好，但不穩(wěn)定。ELISA對抗IBDV VP2抗體的檢出率低于AGP，這種現(xiàn)象與本實驗室以前報道的結果相似[8]。原因在于IBDV抗體ELISA檢測試劑盒系IBDV全病毒抗原包被的，而用VP2表達產物制備的疫苗是單一的抗IBDV VP2抗體。在抗原決定簇的識別上有明顯的差異，由此導致陽性檢出率低。雖然IBDV抗體的ELISA檢測結果無樣本達到試劑盒規(guī)定的陽性標準，但其D650nm的變化規(guī)律與AGP相似，可以作為AGP的參考。

表3 SPF雞不同免疫途徑隨時間變化的IBDV和PM抗體D650nm檢測統(tǒng)計(平均值±標準差)

2.4 不同免疫途徑的PM抗體ELISA檢測

PM抗體的ELISA檢測結果表明只有注射組在免疫后6周達到陽性標準(表3)。D650nm的變化規(guī)律顯示殼聚糖佐劑和明膠佐劑灌胃組較好。從表3可看出，除注射組外的另幾組中略占優(yōu)勢的是2組殼聚糖佐劑灌胃途徑，其中3組明膠佐劑灌胃途徑第4周抗體IgG水平與之接近(P<0.01)；殼聚糖佐劑灌胃組與滴鼻組免疫效果差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

PM重組表達載體菌在體外的表達產物用IBDV VP2抗血清瓊脂擴散免疫擴散能檢測出來，說明該PM重組菌株在體外表達了有VP2免疫原性的蛋白。此次免疫試驗后的SPF雞活動、飲食、代謝都沒太大影響，表明了這種PM重組活疫苗較安全，有良好的應用前景。本研究免疫后的SPF雞抗體水平雖然較弱，但與對照組相比有顯著性差異。表明自制的重組活載體PM二價疫苗還是有一定的免疫作用。一方面弱毒活載體疫苗雖然可以產生一定的粘膜免疫和體液免疫，但受免疫方法和途徑影響，且疫苗激發(fā)機體產生的免疫水平通常較低。注射免疫效果雖好，但使用不方便，且不利于大規(guī)模養(yǎng)殖；灌胃免疫雖利于重復接種卻很容易造成疫苗被消化道降解，導致疫苗吸收效率低；滴鼻點眼也只能使疫苗在鼻腔內存在15min，不能激發(fā)較高的粘膜免疫[9]。另一方面本研究中免疫間隔時間過短及頻繁免疫，使抗原的頻繁刺激機體應答反應疲勞，造成免疫受抑制[10]。此外本研究選用的PM R473是從牛體內分離得到的菌株，與禽類PM存在一定差異，對禽類動物的毒力較弱，感染SPF雞能力不是很強，誘導機體產生的免疫應答較弱且免疫維持時間短，使活載體疫苗的體液免疫效價不高，具細胞免疫和粘膜免疫的效果和對實驗雞的保護作用還未進行全面的檢測。

本研究中IBDV抗體ELISA檢測試劑盒系IBD全病毒抗原包被，檢測抗體滴度較高，而重組活載體疫苗是由VP2蛋白激發(fā)SPF雞產生的抗體，對該試劑盒包被抗原不太敏感，因此需建立一種科學有效的與IBDV VP2抗原特異結合的抗體檢測方法。采用的2種佐劑在一定程度上提高了疫苗的免疫效果，說明殼聚糖和明膠可作為良好的黏膜免疫佐劑。采用多大劑量以及如何優(yōu)化這2種佐劑制備工藝，進一步激發(fā)機體免疫反應，提高機體免疫力水平，還有待深入研究。

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2013-01-20

黃巧珍(1986-)，女，碩士生，主要從事動物基因工程疫苗研究。

榮 俊，E-mail：rongjun59626@gmail.com。

S852.4

A

1673-1409(2013)05-0044-05