陳 ，郜俊清，金惠根，劉宗軍，趙德強(qiáng)

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200062)

補(bǔ)氣化痰方對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200062)

目的：研究補(bǔ)氣化痰方對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后的影響及可能的機(jī)制。方法：將經(jīng)氧化低密度脂蛋白損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞分為5組：補(bǔ)氣化痰方藥物血清低、中、高劑量組，模型組和正常對(duì)照組。用MTT法觀察補(bǔ)氣化痰方藥物血清對(duì)經(jīng)氧化低密度脂蛋白損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制作用的保護(hù)；采用westernblot檢測(cè)法測(cè)定細(xì)胞VEGF蛋白水平探討其可能的機(jī)制。結(jié)果：補(bǔ)氣化痰方藥物血清能減少經(jīng)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷生長(zhǎng)的抑制，并通過(guò)上調(diào)VEGF蛋白途徑達(dá)到抑制氧化低密度脂蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。結(jié)論： 補(bǔ)氣化痰方對(duì)氧化低密度脂蛋白導(dǎo)致對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其可能的機(jī)制是上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

補(bǔ)氣化痰方；瓜蔞薤白半夏湯；氧化低密度脂蛋白；血管內(nèi)皮細(xì)胞；VEGF

血脂代謝紊亂其中低密度脂蛋白(LDL)的上升是動(dòng)脈硬化形成的主要因素,低密度脂蛋白經(jīng)過(guò)氧化修飾后，將生成氧化低密度脂蛋白(OXLDL),氧化低密度脂蛋白與低密度脂蛋白相比具有更強(qiáng)的致動(dòng)脈粥樣硬化的作用。一些研究證實(shí)，氧化低密度脂蛋白能夠通過(guò)細(xì)胞凋亡的途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡[1-5]。張仲景的《金匱要略》中論到，瓜蔞薤白半夏湯主要治療痰盛瘀阻型胸痹，而心肌梗死真心痛，其病機(jī)多為氣虛，并兼有痰濁瘀阻，故課題組在經(jīng)典方的基礎(chǔ)上，增加了黃芪，補(bǔ)氣用以行氣，使經(jīng)典方既擁有化痰祛邪的作用，又兼顧補(bǔ)氣扶正的作用。研究顯示，黃芪能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，瓜蔞薤白半夏湯能夠增加血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)活性。本研究觀察補(bǔ)氣化痰方對(duì)氧化低密度脂蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用及可能存在的機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞采用豬髂動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株(PIEC)，來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海分院細(xì)胞所提供；氧化低密度脂蛋白，由上海亞培生物有限公司提供；補(bǔ)氣化痰方：黃芪、瓜蔞、半夏、薤白，經(jīng)過(guò)大火煮沸后再用小火繼續(xù)燒20min，將藥液燒至約100mL，再依照不同分組濃度為正常人使用劑量的2、4、8倍，根據(jù)大鼠與人體體表面轉(zhuǎn)換，大鼠需要服藥劑量為0.9mL/100g。

1.2 動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠共20只，8～12周齡，雄性，體質(zhì)量約(250±30)g。動(dòng)物飼養(yǎng)按照動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.3 主要試劑MTT，由sigma公司提供；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEN(高糖)，由GIBCOE公司提供；細(xì)胞裂解液，由碧云天生物公司提供；VEGF一抗，由Stressgen公司提供；Westernblot二抗，由sigma公司提供；封閉液，由碧云天生物公司提供。

1.4 主要設(shè)備分光光度計(jì)bio-photometer，由eppendorf公司提供；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀Model680，由BIO-RAD公司提供；高速離心機(jī)centrifuge5804R，由eppendorf公司提供；低速離心機(jī)centrifuge5702，由eppendorf公司提供。

2 方法

2.1 藥物血清制備 雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為補(bǔ)氣化痰高、中、低劑量組和空白對(duì)照組，每組20只，補(bǔ)氣化痰方組按照分組要求給予灌胃(藥物使用量等同于臨床用量的2、4、8倍)，對(duì)照組進(jìn)行等體積的0.9%氯化鈉灌胃，1d給藥2次，共5d，最后一次灌胃前不禁水、禁食12h。末次給藥后1h，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉麻醉，無(wú)菌條件下分離腹主動(dòng)脈取血，靜置血液2h，再經(jīng)過(guò)3 000r/min離心10min，取離心上清液3mL左右，56 ℃水浴滅活30min，用微孔濾膜0.22μm除菌，分裝，-20 ℃進(jìn)行凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 培養(yǎng)液的配制 將10gDMEN干粉加入900mL三蒸水中，再加入10mL雙抗，并加入NaHCO3，HEPES，用0.22μm微孔濾膜除菌。

2.3 細(xì)胞的傳代 血管內(nèi)皮細(xì)胞采用已配制好的10%高糖DMEN培養(yǎng),在37 ℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)。干預(yù)時(shí)在細(xì)胞未對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞懸液依照1:2速率傳代細(xì)胞。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組 1)對(duì)照組(正常鼠血清培養(yǎng)液)；2)模型組(正常鼠血清培養(yǎng)液+200μg/mLOXLDL)；3)治療組：不同劑量含藥鼠血清培養(yǎng)液+200μg/mLOXLDL。

2.5 細(xì)胞處理當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至80%,用0.25%胰酶進(jìn)行消化，在血球板上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液濃度調(diào)整到5×104個(gè)/mL。將細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中,每孔中加入100μL細(xì)胞懸液。培養(yǎng)12h后，根據(jù)分組加入不同鼠血清培養(yǎng)液200μL。培養(yǎng)2h后在培養(yǎng)孔中加入OXLDL使其在治療組及模型組的藥物終末濃度為200μg/mL。

2.6 不同濃度的補(bǔ)氣化痰方對(duì)經(jīng)氧化低密度脂蛋白損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 將血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)2d，每組重復(fù)5孔，加入MTT，4h后，加入DMSO混勻，測(cè)定540nm波長(zhǎng)處的吸光值(OD值)。

2.7 補(bǔ)氣化痰方對(duì)OXLDL損傷PIEC后細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá) 將經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞培養(yǎng)48h后,將400μL含PMSF的裂解液加入每瓶細(xì)胞中，然后將液體移至離心管中，經(jīng)過(guò)4 ℃、12 000r/min離心5min，取上清液分裝于EP管中。提取蛋白，取40μg蛋白上樣進(jìn)行電泳，待溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。分別進(jìn)行一抗及二抗反應(yīng)。最后在暗室中顯影、定影，晾干。凝膠圖象分析。

3 結(jié)果

3.1 各種濃度的補(bǔ)氣化痰方對(duì)經(jīng)氧化低密度脂蛋白損傷大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞后生長(zhǎng)的影響 補(bǔ)氣化痰方在10%血清下能有效抑制OXLDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,在3個(gè)不同劑量濃度范圍內(nèi)其濃度與抑制作用呈正線性相關(guān)，圖1。

在相同時(shí)間條件下，與模型組比較#P<0.05。 圖1 不同濃度補(bǔ)氣化痰方對(duì)經(jīng)OXLDL損傷大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞后生長(zhǎng)的影響

圖2 補(bǔ)氣化痰方對(duì)經(jīng)OXLDL損傷PIEC后VEGF蛋白的影響

圖3 補(bǔ)氣化痰方對(duì)經(jīng)OXLDL損傷PIEC后VEGF蛋白的影響

3.2 補(bǔ)氣化痰方對(duì)OXLDL損傷PIEC后細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá) 經(jīng)過(guò)OXLDL損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞，其抑凋亡蛋白Bcl-2呈現(xiàn)高表達(dá)，促凋亡蛋白BAX呈現(xiàn)低表達(dá)，但是經(jīng)含補(bǔ)氣化痰方藥物血清預(yù)處理過(guò)后，BAX表達(dá)明顯下調(diào)，Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2、圖3。

4 討論

冠心病在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有記載。中醫(yī)稱(chēng)冠心病為胸痹，在患者癥狀方面有記載，《素問(wèn)·藏氣法時(shí)論篇》說(shuō)：“心病者，胸中痛，脅支滿，脅下痛，膺背肩胛間痛，兩臂內(nèi)痛?！睂?duì)重癥胸痹患者，《靈樞·厥論》篇指出：“真心痛，手足青至節(jié)，心痛甚，旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死?！?/p>

LDL升高是血管動(dòng)脈粥樣硬化形成的主要因素，低密度脂蛋白經(jīng)過(guò)氧化作用后，轉(zhuǎn)變成為氧化低密度脂蛋白(OXLDL)，氧化低密度脂蛋白具有較低密度脂蛋白更強(qiáng)的致動(dòng)脈粥樣硬化的作用。一些研究證實(shí)，氧化低密度脂蛋白能夠通過(guò)細(xì)胞凋亡的途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡[1-5]。目前研究顯示，胸痹冠心病病機(jī)多為氣虛、痰濁、血瘀[6-8]。張仲景《金匱要略》中瓜蔞薤白半夏湯主要治療痰盛瘀阻型胸痹。心肌梗死真心痛病機(jī)特點(diǎn)多為氣虛，也兼有痰濁瘀阻，故課題組在經(jīng)典方的基礎(chǔ)上，增加黃芪補(bǔ)氣藥物，主要為了補(bǔ)氣以行氣，使金匱要略經(jīng)典組方既具備化痰祛邪的作用，又具有補(bǔ)氣扶正的作用。近期研究[9-11]顯示，瓜蔞薤白半夏湯能改善冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮的功能，以達(dá)到減少心肌損傷，并可改善缺血引起心絞痛的癥狀，并有降低血脂作用。本研究在金匱要略經(jīng)典方基礎(chǔ)上，大劑量使用補(bǔ)氣藥物黃芪，旨在補(bǔ)氣以行氣，祛邪兼扶正。

本研究顯示，補(bǔ)氣化痰方能抑制氧化低密度脂蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，在一定劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴性。高劑量補(bǔ)氣化痰方能顯著減輕經(jīng)OXLDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，這一作用可能是通過(guò)調(diào)控凋亡調(diào)節(jié)蛋白的作用達(dá)到。BCL-2是一種抑制凋亡過(guò)程的蛋白,而B(niǎo)AX是一種促進(jìn)凋亡過(guò)程的蛋白[12-13]。補(bǔ)氣化痰方可通過(guò)上調(diào)BCL-2凋亡抑制蛋白及下調(diào)BAX凋亡促進(jìn)蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)氧化低密度脂蛋白對(duì)豬髂動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抑制作用。

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R543.1

A

1003-5699(2013)06-0612-03

國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)專(zhuān)科建設(shè)項(xiàng)目課題(2011Z059)。

*[通信作者] 趙德強(qiáng)，Tel:13816985971,E-mail:kevingjq@163.com。

2013-01-16)