夏 穎 殷志爽 石 晨 王 橋 宋學英

(1.首都醫(yī)科大學化學生物學與藥學院實驗中心，北京100069;2.北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司產品開發(fā)部，北京100012;3.首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與測試中心，北京100069)

自由基是人體生命活動中多種生物化學反應的中間代謝產物。正常情況下，人體內的自由基處于不斷產生和不斷消除的動態(tài)平衡中，適量自由基的存在對維持機體的正常代謝是必不可少的。但是當自由基產生過多或消除過慢時，體內累積過多的自由基會造成機體在分子水平、細胞水平及組織水平的損傷而誘發(fā)疾病［1－2］。

白芍是一種常用的中藥材，有文獻［3］報道顯示白芍提取物具有抗氧化清除自由基的活性，但并未確定提取物中抗氧化有效成分。在前期的研究［4］中發(fā)現(xiàn)，白芍中含有一種生物活性成分，五沒食子?；咸烟?pentagalloylglucose，PGG)，其化學結構見圖1。

圖1 五沒食子?；咸烟堑幕瘜W結構Fig.1 Chemical structure of pentagalloylglucose

PGG分子中含有多個酚羥基的結構賦予了它一系列獨特的理化性質和生理活性，根據(jù)其結構特點，提示PGG將可能成為一種天然抗氧化劑而具有潛在的廣泛應用前景。

1，1－二苯基 －2－苦基苯肼自由基法(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH)和 Fe3+－三吡啶三吖嗪法(ferric reducing－antioxidant power，F(xiàn)RAP)法是常用的2種檢測物質抗氧化活性方法。

DPPH· 是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基。其作用模式為AH+DPPH→·DPPH·H+A·其中，AH代表自由基清除劑(抗氧化劑)。通過物質對DPPH·自由基的清除情況，可以評價其抗氧化能力［5－7］。通常抗氧化能力用殘留率來表示，殘留率越小，抗氧化能力越強。DPPH·殘留率計算公式如下:

其中，［DPPH·］REM為 DPPH·殘留率，［DPPH·］T為自由基清除過程中某一時刻DPPH·的質量濃度，［DPPH·］T=0為DPPH的原始質量濃度。在一定的濃度范圍內，當自由基清除劑與DPPH·反應達到平衡時，自由基清除劑的濃度越大，則DPPH·的殘留率越小，即DPPH·的殘留率與自由基清除劑濃度成反比。故測定不同濃度的自由基清除劑與DPPH·反應達到平衡時DPPH·的殘留率，即可得到殘留率與清除劑濃度的線性回歸方程。由方程計算殘留率為50%所對應的清除劑濃度即為清除劑的半抑制濃度IC50。IC50越小，表明清除劑清除自由基抗氧化能力越強。自由基的清除能力(antiradical efficiency，AE)可以用IC50的倒數(shù)來表示AE=1/IC50。根據(jù)AE可以判斷抗氧化劑清除自由基的能力大小，AE越大表示其清除自由基能力越強，抗氧化活性越強。DPPH·法測定簡便、快速，而且由于DPPH·有較長的半衰期而使此方法具有良好的重現(xiàn)性，可用于有效地評價抗氧化劑的活性，因而此方法被廣泛用于評價清除自由基物質的抗氧化能力及天然抗氧化劑的篩選。

由Benzie等［8］建立的 FRAP 法是通過 Fe3+－三吡啶三吖嗪［Fe(III)－TPTZ］在酸性溶液中可以被樣品中的還原性物質還原成Fe(Ⅱ)呈現(xiàn)明顯的藍色，在593nm處具有最大吸收。樣品溶液的吸光度值越大，表明生成Fe(Ⅱ)越多，樣品還原能力越強，故可以用樣品與Fe(III)－TPTZ作用生成Fe(Ⅱ)的多少來評價樣品抗氧化活性的強弱。用FRAP值表示樣品抗氧化活性的強弱，F(xiàn)RAP在數(shù)值上等于樣品與Fe(III)－TPTZ反應后在593nm處的產生的吸光值所相當?shù)臉藴蔉eSO4溶液的濃度(μmol/L)。FRAP值越大，表示樣品抗氧化活性越強［7］，顯示出較強的抗氧化能力，而使機體內免受Fe3+等氧化劑的損傷。該方法原理明確，操作簡便，易于標準化。FRAP法常用于測定不同抗氧化物質、食物與生物樣品的抗氧化活性。

本文采用高速逆流色譜(high－speed current chromatography，HSCCC)方法，從白芍中提取分離得到其抗氧化有效成分PGG固體粉末。通過DPPH法和FRAP法2種體外抗氧化檢測方法對白芍提取物及其有效成分PGG的抗氧化活性進行體外評價。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

2695型高效液相色譜系統(tǒng)(包含四元梯度泵、2996型二極管陣列紫外檢測器、empower色譜工作站，美國Waters公司);液相色譜－質譜聯(lián)用儀(包含Quattro microTMAPI質譜、2695型四元梯度泵、2487型紫外檢測器、氦氣脫氣機、Masslynx 4.0質譜工作站，美國Waters公司);HSCCC－TBE 300A型高速逆流色譜儀(包含8823B型紫外檢測器、TBP－50A型泵，上海同田生化技術有限公司);UV－2550型紫外分光光度計(日本 SHIMADZU公司);真空干燥儀(美國Labconco公司)。

白芍(產地安徽亳州)購自北京同仁堂藥店;PGG(純度＞98%)購自中山康之源生物科技有限公司;三吡啶三吖嗪(2，4，6－tripyridyl－s－triazine，TPTZ;Alfa Aesar，德國)，DPPH·，Alfa Aesar，德國)，乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司德國)，維生素C(Vitamin C，Vc;北京化工廠)，其他試劑均為市售分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 白芍粗提物的制備及PGG的分離純化

采用本實驗室前期建立的HSCCC方法從白芍中分離純化PGG［9］，即將白芍粉碎后用50%乙醇－水溶液超聲提取，將提取液減壓旋干后用水溶解，用乙酸乙酯萃取，將萃取液減壓旋干得到白芍粗提物。然后，將粗提物用HSCCC方法進行分離純化，主機轉速為800 r/min，流動相的流速為2.0 mL/min，洗脫方式為從頭至尾的方式，用紫外檢測器在280 nm處在線監(jiān)控。先采用一種溶劑體系(正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水，0.5 ∶5∶1 ∶5)進行洗脫，根據(jù) HSCCC 譜圖收集含有目標化合物PGG的吸收峰的洗脫液，減壓旋干得到初分物。然后，再用另一種溶劑體系(正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水，0.5∶5∶0.5∶5)將初分物用HSCCC進一步分離，根據(jù)HSCCC譜圖收集PGG的吸收峰，減壓旋干得到棕色PGG粉末。PGG的檢測分析方法采用本實驗室前期建立的HPLC方法進行［10］。

1.2.2 白芍粗提物及PGG清除DPPH·活性的測定

1)標準曲線的繪制:準確稱取DPPH· 2.5 mg，用乙醇配制成質量濃度為25 μg/mL的標準儲備液。分別取 0、2.0、4.0、6.0、8.0 和 10.0 mL，用乙醇定容到10 mL，配制 DPPH·質量濃度分別為 0、5、10、15、20和25 μg/mL系列標準溶液。以乙醇為空白，測定上述標準溶液在517 nm波長處的吸光度。以DPPH·濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程為 y=0.0319x+0.040，r2=0.9994。

2)DPPH·清除率的測定:選用Vc作為陽性對照藥，用乙醇為溶劑，分別將白芍粗提物、PGG和Vc配成一系列待測溶液(濃度分別為 0、25、50、100 μg/mL)。分別取上述各溶液0.10 mL，加入質量濃度為25 μg/mL的DPPH·標準液3.90 mL，搖勻混合液。以乙醇為空白，用紫外－可見分光光度計在517 nm處測定其在不同時間的吸光值。根據(jù)標準曲線換算成相應的DPPH· 的質量濃度，計算DPPH· 殘留率。以時間t為橫坐標，DPPH· 殘留率為縱坐標繪制白芍粗提物、PGG及Vc清除DPPH·的曲線，得到不同濃度樣品的殘留率隨時間變化的曲線。

1.2.3 用FRAP法測定白芍粗提物及PGG的抗氧化活性

1)FRAP標準曲線的繪制:參照Benzie等［8］的方法并進行了進一步修改。按照體積比為10∶1∶1的比例，精確量取醋酸鈉緩沖液(0.3 mol/L，pH3.6)、TPTZ溶液(10 mmol/L)及標準FeSO4溶液，混勻，即得 FeSO4標準系列溶液(濃度分別為10、25、100、150、200、400、500 μmol/L)。

分別取4.0 mL各FeSO4標準溶液，在37℃反應30 min，然后測定溶液在593nm處吸光度。以FeSO4濃度為縱坐標(表示為FRAP值)，吸光度為橫坐標，繪制FRAP標準曲線，其回歸方程為 y=524.67x－2.0301，r2=0.999 9。

2)抗氧化活性(FRAP值)的測定:TPTZ工作液的配制:TPTZ工作液由0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)，10 mmol/L TPTZ 溶液和 20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液組成，三者按體積比為10∶1∶1混合而成。TPTZ工作液需要現(xiàn)用現(xiàn)配［8］。

用乙醇為溶劑，分別將白芍粗提物、PGG和Vc配制成一系列待測溶液(濃度分別為10、25、50和100 μg/mL)，分別取0.20 mL各濃度的待測溶液，加入3.80 mL新鮮配制的TPTZ工作液，混勻。在37℃反應30 min后，測定波長為593 nm處吸光度。每份溶液平行操作3次，取平均值。依據(jù)FRAP標準曲線計算各溶液的抗氧化活性(FRAP值)。

2 結果

2.1 白芍粗提物經(jīng)HSCCC分離純化得到PGG

將白芍粉碎經(jīng)乙醇提取得到粗提物，通過HSCCC分離純化得到棕色PGG固體粉末，經(jīng)HPLC檢測該固體粉末為單一組分(圖2A)，用歸一化法測定其純度為95.7%;將其HPLC譜圖與對照品PGG的HPLC譜圖比較，表明該化合物為PGG;用ESI－MS檢測其質荷比m/z為939.5(圖2B)，其相對分子量與PGG分子式C41H32O26吻合，進一步證明該化合物為PGG。

圖2 PGG的HPLC譜圖(A)和質譜圖(B)Fig.2 HPLC chromatogram(A)and ESI-MS spectrum(B)of the PGG extracted from Radix Paeoniae Alba

2.2 清除DPPH·活性的研究

2.2.1 PGG和白芍粗提物清除DPPH·能力大于Vc

從白芍粗提物、PGG及Vc清除DPPH·的殘留率曲線圖(圖3)可以看到，在相同濃度下，白芍粗提物及PGG均表現(xiàn)出較強的清除DPPH·自由基的能力，DPPH·殘留率明顯低于同濃度Vc，說明白芍粗提物及PGG的抗氧化效果良好，其活性超過陽性對照Vc。

圖3 PGG(A)、白芍粗提物(B)及Vc(C)DPPH·殘留率Fig.3 DPPH· residual rates of PGG(A)，crude extract from Radix Paeoniae(B)and Vc(C)

圖3顯示，隨著抗氧化物質濃度的增大，DPPH·殘留率逐漸降低，清除DPPH·自由基的作用增強。表明抗氧化物質的抗氧化能力隨濃度增大而增強，即白芍粗提物及PGG清除DPPH·的作用呈一定的量－效關系。當反應到30 min時，各樣品溶液基本達到平衡。在PGG、白芍粗提物及Vc濃度同為100 μg/mL時，DPPH·殘留率分別為27.2%、33.8%、52.7%，即PGG＜白芍粗提物＜Vc。這說明抗氧化能力PGG＞白芍粗提物＞Vc。

此外，從圖3還可見以看到，在DPPH·溶液中加入Vc溶液后，開始DPPH·殘留率迅速下降，但在5 min左右即達到穩(wěn)定，此后隨著時間的延長DPPH·殘留率幾乎不再發(fā)生變化，也就是說，5 min以后Vc不再使DPPH·減少;而PGG和白芍粗提物可以維持較長的時間清除DPPH·直到約30 min殘留率才達到穩(wěn)定。

2.2.2 白芍粗提物及PGG與Vc清除能力的比較

由圖 3可知，當白芍粗提物、PGG和 Vc與DPPH·反應30 min時，各反應體系基本達到平衡狀態(tài)。分別計算各溶液在與DPPH·反應30 min(即平衡)時DPPH·的殘留率，以殘留率y對濃度x做線性回歸，計算IC50和AE(表1)。

表1 白芍粗提物和PGG對DPPH·的清除能力Tab.1 Antiradical efficiency of scavenging DPPH·of the samples

表1給出DPPH·殘留率y與樣品濃度x關系的線性回歸方程、半抑制濃度IC50和自由基清除能力AE。由表1可以看出，清除DPPH·能力AE的大小順序為PGG＞白芍粗提物＞Vc，且PGG的IC50不足Vc的1/2，提示PGG的抗氧化能力高于Vc，將可能成為一種潛在的高效抗氧化劑。

2.3 樣品抗氧化/能力檢測

FRAP值可以表示樣品抗氧化能力的強弱，白芍粗提物、PGG和Vc在不同濃度下的FRAP值詳見表2。

表2 不同濃度下白芍粗提物、PGG的FRAP值Tab.2 RAP values of the samples in the different concentrations(μg/mL)

從表2可以看到:①對于同一物質(如PGG、白芍粗提物或Vc)，隨著樣品濃度的增大，溶液FRAP值增大，說明其抗氧化活性隨著樣品濃度的增大而增加。②在同一樣品濃度下，PGG的FRAP值最大，抗氧化能力最強;其次是白芍粗提物，其FRAP值也大于Vc。這說明PGG和白芍粗提物的抗氧化活性均高于陽性對照Vc，抗氧化能力順序為PGG＞白芍粗提物＞Vc。③當樣品濃度較低(如 10 μg/mL)時，Vc的FRAP遠小于PGG和白芍粗提物，可是隨著樣品濃度的增大，各物質抗氧化能力均有所增強，而Vc抗氧化能力增加得更為顯著。當濃度達到100 μg/mL時，Vc的FRAP已經(jīng)達到420.8 μmol/L，接近白芍粗提物(421.3 μmol/L)，但 PGG的抗氧化能力仍最強(FRAP值為576.1 μmol/L)，即在樣品濃度為100 μg/mL時，抗氧化能力為PGG＞白芍粗提物≈Vc。

3 討論

通過DPPH法和FRAP法兩種檢測體系，研究白芍粗提物及其有效成分PGG的抗氧化作用。實驗結果表明，與陽性對照Vc相比，白芍粗提物和PGG均具有較強的抗氧化活性，且在一定的范圍內，濃度越大抗氧化能力越強，其抗氧化作用與濃度呈量效關系。在DPPH·清除實驗中，白芍粗提物和PGG均顯示了良好的清除自由基的能力，在濃度為10～100 μg/mL范圍內，其抗氧化活性均高于Vc;在FRAP抗氧化實驗中，白芍粗提物和PGG同樣顯示了較強的抗氧化能力，但FRAP實驗結果與DPPH法所得結果稍有差別的是當樣品濃度較大時(如100 μg/mL時)，Vc的抗氧化活性接近白芍粗提物，但仍低于PGG。

總之，本實驗對白芍粗提物及其有效成分PGG的抗氧化作用的研究結果表明，在中藥白芍中含有抗氧化有效成分PGG。與陽性對照Vc相比，白芍粗提物和PGG具有較強的清除自由基及抗氧化活性，且PGG的抗氧化作用遠大于陽性對照藥Vc。研究結果提示PGG將有可能成為一種潛在的天然高效低毒的抗氧化劑廣泛地應用于臨床。

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