路 欣 許 晴 翁 靜

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)示范中心形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測試中心，北京100069;3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，北京100069)

妊娠過程中，母體通常情況下不排斥帶有父源性成分的胚胎，而是“允許”其“種植”并生長發(fā)育，對(duì)于這一特殊的免疫現(xiàn)象，盡管已有大量的研究，但仍然沒有得到肯定的解答。目前認(rèn)為正常妊娠時(shí)，在母體-胚胎接觸面上所具有的免疫特殊性，與激素、細(xì)胞因子以及免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞密切相關(guān)［1］。在母體與胚胎直接接觸的蛻膜，有大量的免疫相關(guān)細(xì)胞，其中自然殺傷細(xì)胞(natual killer cell，NK)是最為主要的一類細(xì)胞。子宮NK細(xì)胞類似于僅占外周血中NK細(xì)胞總數(shù)10%的CD56brightCD16-NK細(xì)胞，表現(xiàn)為弱的細(xì)胞毒性，其功能的發(fā)揮以產(chǎn)生細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)［2］。

在人類分泌期的子宮內(nèi)膜也有NK細(xì)胞，但有研究［3-4］顯示，非妊娠和妊娠后存在的子宮自然殺傷細(xì)胞在表面標(biāo)志、分泌的活性物質(zhì)以及可能的功能等很多方面有一定差異，所以以子宮內(nèi)膜自然殺傷(endometrial NK，eNK)細(xì)胞和蛻膜自然殺傷(decidual NK，dNK)細(xì)胞分別描述更為科學(xué)。在小鼠，dNK細(xì)胞于妊娠期出現(xiàn)在子宮，典型的細(xì)胞以含有經(jīng)淀粉酶消化后高碘酸-雪夫(Periodic acid-Schiff)陽性反應(yīng)顆粒為特征［5］。但是對(duì)于無顆粒的不典型dNK細(xì)胞，PAS不能很好地顯示。有研究［6］顯示雙花扁豆凝集素(Dolichos Bifows Agglutinin，DBA)可以高選擇性地與糖復(fù)合物末端的N-乙酰-D-半乳糖胺(N-acetyl-D-galactosamine)結(jié)合，在小鼠子宮僅與dNK細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)反應(yīng)，是繼PAS法之后又一種標(biāo)記小鼠dNK細(xì)胞的手段。

本文分別采用PAS、DBA以及DBA加PAS雙重標(biāo)記顯示dNK細(xì)胞，比較不同方法的差異。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

昆明系成年小白鼠，7～10周齡，體質(zhì)量25 g，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2005－0006］。雌雄分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為自然光照，溫度20℃ ～26℃、濕度40% ～70%，自由取食。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。分籠飼養(yǎng)的小鼠每晚5時(shí)按雌雄比2:1進(jìn)行合籠，次日早晨8時(shí)檢查雌鼠陰道，發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)日記為妊娠第1天(Gd 1)。

取 Gd 1～3，Gd 4～6，Gd 7～9，Gd 10～13，Gd 14～16，Gd 17～19天小鼠各5只，頸椎脫臼法處死，取出妊娠子宮，Gd 10天以前保留胚胎，之后去除胚胎，但盡量保留胎盤和子宮的相對(duì)位置。包埋面取垂直于子宮長軸，鄰近胚胎植入部位。取厚度為4μm的連續(xù)切片，分別進(jìn)行常規(guī)HE染色、PAS染色和DBA反應(yīng)。

1.2 方法

1)PAS反應(yīng)的主要步驟:切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇下行入水;經(jīng)唾液淀粉酶作用后，入0.5%高碘酸溶液，室溫氧化;洗滌后入雪夫試劑，室溫避光作用15 min;SO2水浸洗，蒸餾水洗滌;Ehrlich蘇木精復(fù)染核;經(jīng)上行乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2)生物素標(biāo)記的雙花扁豆凝集素(bio-DBA)的組織化學(xué)反應(yīng)的主要步驟:切片經(jīng)二甲苯脫蠟入水;3%H2O2，去除內(nèi)源性過氧化物酶;加bio-DBA(Sigma公司)，4℃過夜(陰性對(duì)照以PBS液代替bio-DBA);加帶有辣根過氧化物酶的卵白素，室溫，30 min;二氨基聯(lián)苯胺顯色2～5 min;自來水沖洗終止反應(yīng)，蒸餾水洗，經(jīng)上行乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。每一步驟間經(jīng)PBS充分洗滌。

3)DBA加PAS雙重反應(yīng):bio-DBA反應(yīng)如上所述，DBA顯色后，入1%高碘酸溶液，其余操作同1.2.1所述。

1.3 結(jié)果判斷

PAS反應(yīng)陽性結(jié)果表現(xiàn)為紫紅色;DBA陽性反應(yīng)結(jié)果呈現(xiàn)棕黃色，細(xì)胞數(shù)量采用Leica Q500IW型圖像分析儀分析，每個(gè)樣本于40倍物鏡下隨機(jī)取5個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取同一妊娠時(shí)期每個(gè)高倍視野平均陽性數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠子宮組織學(xué)結(jié)構(gòu)

小鼠子宮自腔面向外可見內(nèi)膜、肌層以及被覆其外的漿膜。在漿膜向子宮系膜延續(xù)的部位，形成一個(gè)在橫斷面上呈三角形的區(qū)域(即系膜三角區(qū))，該部位主要在妊娠后，特別是在胚胎“種植”后細(xì)胞數(shù)明顯增多，改稱謂子宮腺細(xì)胞區(qū)(圖1A)。隨著胚胎的“種植”，子宮腔逐漸縮小直至消失。胎盤結(jié)構(gòu)于妊娠第10天基本形成(圖1B)。自妊娠第3天起蛻膜中可見一些圓形細(xì)胞，胞質(zhì)染色比較淺，有些細(xì)胞的胞質(zhì)中可見一些細(xì)小的顆粒，這種細(xì)胞自妊娠第8天起大量出現(xiàn)于子宮腺細(xì)胞區(qū)(圖1C)。

2.2 dNK細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)、定位及數(shù)量變化

HE染色中圓形、胞質(zhì)染色比較淺的含有顆粒的細(xì)胞PAS呈陽性反應(yīng)，提示其為dNK細(xì)胞。典型的dNK細(xì)胞直徑約20μm，以胞質(zhì)內(nèi)含豐富的被染成紫紅色的PAS陽性顆粒為特點(diǎn)，而這些細(xì)胞在DBA反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞膜、顆粒膜以及細(xì)胞核膜均呈棕黃色(圖2)。

利用PAS和DBA標(biāo)記法，在未孕(動(dòng)情周期各期)小鼠子宮內(nèi)膜中未顯示出有典型的dNK細(xì)胞。DBA標(biāo)本上，妊娠第3天即可在內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)體積較小，但細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜呈棕黃色的陽性反應(yīng)細(xì)胞，胞質(zhì)中沒有明顯顆粒;而連續(xù)切片PAS反應(yīng)標(biāo)本，相同部位的細(xì)胞則未見明顯陽性反應(yīng)(圖3)。妊娠第10天以前的標(biāo)本上，DBA陽性細(xì)胞多于PAS陽性細(xì)胞。而隨著dNK細(xì)胞中陽性顆粒的逐漸增多，基蛻膜和子宮腺細(xì)胞區(qū)中兩種標(biāo)記顯示的陽性細(xì)胞數(shù)相對(duì)一致。對(duì)高倍視野下2種方法標(biāo)記的陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)見表1。

DBA反應(yīng)后再進(jìn)行PAS反應(yīng)，即雙重標(biāo)記顯示，大部分dNK細(xì)胞的胞膜、細(xì)胞核膜呈棕黃色，胞質(zhì)中含有紫紅色和棕黃色2種顏色的顆粒;妊娠第8天以后的標(biāo)本上，可見少量細(xì)胞的顆粒僅呈現(xiàn)PAS陽性(圖4)。

表1 PAS和DBA標(biāo)記不同妊娠時(shí)間陽性細(xì)胞分布計(jì)數(shù)(平均每高倍視野細(xì)胞數(shù))Tab.1 The number of PAS/DBA positive cells at different pregnant time(avery cell count per high power field)

圖4 妊娠小鼠子宮，DBA加PAS雙重反應(yīng)Fig.4 Pregnant uteri of mice，PAS/DBA double reactions protocol

3 討論

DBA高選擇性地與N-乙酰-D-半乳糖胺結(jié)合，盡管目前還不清楚DBA結(jié)合的半乳糖胺的功能意義，但因其僅與dNK細(xì)胞膜及顆粒膜結(jié)合，而與外周NK細(xì)胞以及子宮中其他淋巴細(xì)胞不反應(yīng)，正在成為繼PAS反應(yīng)之后又一種標(biāo)記小鼠dNK細(xì)胞的手段［6-7］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PAS和雙花扁豆凝集素組織化學(xué)法均可以標(biāo)記典型的dNK細(xì)胞。2種標(biāo)記方法同時(shí)應(yīng)用時(shí)dNK細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜和顆粒膜呈現(xiàn)DBA陽性，而顆粒呈紫紅色PAS陽性反應(yīng)。兩種方法存在一些不同:在妊娠早期(Gd3-Gd6)DBA可以顯示沒有顆粒的dNK細(xì)胞，因此計(jì)數(shù)的DBA陽性細(xì)胞數(shù)多于PAS染色的陽性細(xì)胞數(shù)。提示DBA標(biāo)記在妊娠早期PAS陽性顆粒尚未出現(xiàn)的幼稚dNK細(xì)胞。

雙重標(biāo)記的標(biāo)本上，在妊娠第8天以后可見非常少量的細(xì)胞僅表現(xiàn)為PAS陽性，而DBA為陰性，這與早期DBA陽性而PAS染色陰性的結(jié)果正好相反。我們推測這種差異可能是由于dNK細(xì)胞起源差異。目前關(guān)于dNK細(xì)胞的起源還存在爭議:有人認(rèn)為［8-9］dNK細(xì)胞可能源自淋巴器官以及外周血中的NK細(xì)胞;有學(xué)者［10］則提出dNK細(xì)胞源于子宮內(nèi)膜基底層的前體細(xì)胞;還有學(xué)者［11］提出 dNK細(xì)胞可能是由eNK細(xì)胞增生并轉(zhuǎn)化而來。目前尚不能夠確定dNK細(xì)胞為單一來源。

總之，小鼠dNK細(xì)胞可以用PAS和DBA來顯示，以含有PAS陽性顆粒為特點(diǎn)。DBA因與dNK細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜及顆粒膜特異結(jié)合，而成為一種新的dNK細(xì)胞標(biāo)志物，特別適用于妊娠早期。

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