閆 峰 劉向榮 趙海蘋 王榮亮 吉訓明 趙詠梅 陶 真 羅玉敏

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院腦血管病研究室北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053)

腦血管病(cerebrovascular disease，CVD)是目前導致人類死亡的三大主要疾病之一，其高發(fā)病率、高病死率給社會和家庭帶來沉重的負擔。腦卒中是大腦供血障礙，如血栓或外傷等引起的局限或全面性腦功能缺損綜合征。大量長期的臨床調(diào)查［1］表明:絕經(jīng)前婦女卒中的發(fā)病率較同年齡段的男性低，且缺血損傷程度也較輕，絕經(jīng)后婦女卒中的發(fā)病率則顯著增高。上述研究提示體內(nèi)高雌激素水平可能與腦卒中發(fā)生有關(guān)，近年的研究［2］也顯示，雌激素可以促進腦卒中后的神經(jīng)再生。因此在腦卒中的實驗研究中，為了避免雌激素對卒中的影響，通常采用健康的雄性大鼠。另外在腦卒中的研究中還經(jīng)常采用去卵巢雌性大鼠，絕經(jīng)雌性大鼠，或者雄性大鼠作為研究對象，進行長期(2～7 d)生理或高劑量雌激素替代治療觀察雌激素對卒中損傷的保護作用。但正常的生理激素水平下，同等程度損傷下，性別因素對卒中的影響，特別是缺血再灌短期內(nèi)(如24 h)性別因素是否對卒中產(chǎn)生影響這一問題，對動物模型性別的選擇具有指導意義。因此本研究探討了在正常生理激素條件下性別因素對大鼠局限性腦缺血的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用SPF級成年雌性、雄性sprague dawley(SD)大鼠，購自北京維通利華實驗動物公司，實驗動物許可證號:SCXK(京)2012－0001。按性別采用數(shù)字表法隨機分為2組，每組12只，體質(zhì)量280～310g，標準配方飼料喂養(yǎng)，自由進水。大鼠飼養(yǎng)及實驗均在本院SPF級實驗動物室內(nèi)進行。

1.2 實驗儀器

小動物呼吸機(Harvard Apparatus 683)、雙極電凝(德威，DEVEL，ACC100)、顯微鏡(Carl Zeiss)、腦血流監(jiān)測儀(PERIMED，PF5001)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(Harvard Apparatus)、精密電子天平(Adventurer)、Image-Pro Plus計算機圖像分析系統(tǒng)(美國，Larser Sharp)、數(shù)碼照相機(蘇州富士膠片映象機器有限公司)、大鼠手術(shù)操作臺、顯微手術(shù)器械。

1.3 實驗試劑

0.9%NaCl注射液、多聚甲醛、恩氟烷(Enflurane，河北九派制藥)、醫(yī)用耳腦型膠(廣州市香雪生物醫(yī)學工程有限公司)，10%水合氯醛(華瑞制藥)、2，3，5－氯化三苯四氮唑(TTC，伊瑞德生物技術(shù))，磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉(北京化學試劑公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 腦血流監(jiān)測

大鼠稱體質(zhì)量后，在4% ～5%恩氟烷、30%O2/70%N2O下誘導麻醉。約5 min后將其尾部抬起無任何張力且隨重力自然落下表示誘導成功。將大鼠固定于操作臺上，在手術(shù)顯微鏡下進行氣管插管。插管成功后迅速連接動物呼吸機，在1% ～2%恩氟烷、30%O2/70%N2O下維持麻醉。頭頂皮膚備皮消毒后，沿中線切開皮膚，剝離骨膜。腦血流測定點為前囟后方3 mm，中線右側(cè)旁開5 mm處。在上述測定點以牙鉆進行鉆孔開窗，使用醫(yī)用耳腦型膠將直徑為0.5 mm的光學纖維探頭固定在骨窗上，應用激光多普勒監(jiān)測大鼠大腦中動脈供血區(qū)的血流量。

1.4.2 模型制備

將大鼠仰臥于手術(shù)臺上，取頸部正中切口，小心分離皮下脂肪和肌肉、右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸 外 動 脈 (external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動脈 (internal carotid artery，ICA);分離ECA主干，鈍性分離出甲狀腺動脈和枕動脈，并電凝切斷。在CCA分叉處遠端約1cm處結(jié)扎、電灼、切斷ECA，并在CCA分叉處結(jié)扎一道縫合線，不做緊密結(jié)扎。仔細分離ICA至其發(fā)出翼腭動脈(pterygopalatine artery，PPA)和入顱頸內(nèi)動脈處。用微小動脈夾臨時夾閉CCA和ICA，用眼科剪在ECA殘端剪一個小口，插入線栓，扎緊縫合線，松開ICA動脈夾，慢慢推動線栓進入ICA，使其進入ICA入顱動脈支。線栓穿過距ICA和ECA分叉處約2.0cm有阻力感時，表明線栓已將大腦中動脈堵塞，放開CCA動脈夾。當所監(jiān)測的腦血流下降至插栓前20%～40%，說明大腦中動脈的血供已阻斷。MCAO2 h，再灌注24 h后處死。

1.4.3 TTC染色

用于計算腦梗死體積的大鼠再灌注24 h后，腹腔注射過量水合氯醛，深度麻醉后迅速斷頭取腦，觀察鼠腦大體形態(tài)。0～4℃ 0.9%NaCl注射液沖洗后放入模具，去除小腦和腦干，按2 mm厚度連續(xù)做6個腦組織冠狀切片，立即置20 mL·L－1TTC/磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中，37℃恒溫孵育30 min，染色后置40 g·L－1多聚甲醛/PBS中固定6 h，觀察腦組織切片呈色情況并拍照，后以Image-Pro Plus軟件進行梗死面積測定。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用例數(shù)和百分數(shù)表示，組間比較使用Fisher確切概率法。計量資料用均數(shù)±標準差(x ±s)表示，組間比較使用單因素方差分析方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同性別大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后病死率的比較

MCA阻斷24 h內(nèi)的大鼠病死率分別為:正常雄鼠為16.67%，正常雌鼠為8.33%。采用Fisher確切概率法進行假設檢驗，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，n=12)，如圖1所示。

圖1 MCA阻斷24 h內(nèi)的大鼠病死率Fig.1 The mortality rate 2 hours after MCAO and 24 hours reperfusion

2.2 不同性別大鼠腦梗死體積的比較

大鼠MCAO 2 h，再灌注24 h后，處死大鼠，TTC染色檢測腦梗死體積。雌雄2組相比差異有統(tǒng)計學意義，雌性大鼠腦梗死體積明顯小于雄性對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，如圖2所示。

圖2 MCAO2 h，再灌注24 h腦梗死面積比較Fig.2 The infarct volumes 2 hours after MCAO and 24 hours reperfusion

2.3 不同性別大鼠腦血流的比較

腦血流監(jiān)測基礎(chǔ)值雌性為(154±20)PU，雄性為(212±24)PU，雌性顯著低于雄性(P＜0.01);線栓插入后，雌性為(48±3)PU，雄性為(78±21)PU，雌性顯著低于雄性(P＜0.05)，下降百分比雌性為(68±4)%，雄性為(63±12)%，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，n=12);拔栓后腦血流雌性為(159±5)PU，雄性為(196±36)PU，恢復百分比雌性為(104±11)%，雄性為(91±14)%，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，n=12)，詳見圖3、4。

圖3 手術(shù)過程中大鼠腦血流變化Fig.3 Changes of the brain blood flow in operation

圖4 手術(shù)過程中大鼠腦血流變化Fig.4 Changes of the brain blood flow in operation

3 討論

缺血性腦血管病是目前嚴重危害人類健康的主要疾病之一。在我國，隨著老齡化人口增加，缺血性腦血管病發(fā)病率也在不斷提高。臨床資料［2］表明，在缺血性腦卒中患者中，男性和絕經(jīng)后女性腦損傷程度比絕經(jīng)前女性嚴重，絕經(jīng)期前的女性比同齡男性的卒中發(fā)生率低，因此推測雌激素對腦缺血有一定的保護作用。Kooperberg等［3］做了一個樣本數(shù)為27 347人的絕經(jīng)后女性的病例對照研究，證實經(jīng)雌孕激素治療的確可以降低絕經(jīng)后女性的卒中風險。Lisabeth等［4］做了一個樣本數(shù)為1 430人的前瞻性研究，將女性的自然絕經(jīng)年齡分為＜42歲42歲～54歲＞54歲3組，結(jié)果顯示過早絕經(jīng)的婦女組(絕經(jīng)年齡＜42歲)和其他兩組相比發(fā)生缺血性腦卒中的風險增加2倍。以上的研究再一次印證了雌激素對腦缺血有一定的保護作用。

進一步的動物實驗發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷的程度與動物的種類和性別有關(guān)。Alkyaed等［5］在大鼠的大腦中動脈阻塞模型中發(fā)現(xiàn)大腦的受損程度存在著性別差異，雌鼠的腦梗死面積顯著小于同齡雄鼠，并且這種差異隨著雌鼠卵巢的切除而消失。這些研究結(jié)果在不同品系的大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠的研究中亦得到證實。這表明內(nèi)源性雌激素與缺血性腦損傷的發(fā)生以及所造成神經(jīng)組織損傷的嚴重程度密切相關(guān)。Simpkins等［6］采用切除雌性SD大鼠卵巢后MCAO模型，首次證實補充外源性雌激素能明顯降低急性缺血性卒中的發(fā)生率和24 h的病死率，并能縮小梗死面積。Toung等［7］給予雄性大鼠長期應用或即刻給予雌激素預處理后，發(fā)現(xiàn)均能減輕MCAO后的神經(jīng)組織損傷，呈現(xiàn)明顯的腦保護作用。這些研究表明，外源性雌激素對兩性大鼠的缺血性腦損傷都有明顯影響。此后，又有不少學者［8-11］在不同的缺血模型使用不同劑量及劑型的雌激素均發(fā)現(xiàn)了雌激素能減輕缺血性腦損傷。

另外還有學者［12］對雌激素對缺血區(qū)腦血流量的影響進行研究。采用大鼠的腦缺血模型，應用雌激素治療和安慰劑對比結(jié)果顯示雌激素干預可使腦梗死周邊的新生血管密度增加20%，增加了腦血液灌注。此外在半球缺血動物模型上，長期使用雌激素治療可以增加缺血區(qū)的殘余血量［13］。

Vitale等［14］對134名絕經(jīng)后的女性給予雌激素口服治療，通過高頻超聲檢測肱動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能，研究顯示經(jīng)過5年的雌激素治療后和從未用過雌激素治療的女性相比，血管的擴張能力明顯改善，經(jīng)治療后血管表現(xiàn)出更好的彈性，更有利于血液在腦血管中的灌注。

本實驗在生理水平上探討了性別對局灶性大鼠腦缺血模型腦血流及梗死體積的影響。在對大鼠進行MCAO術(shù)中全程監(jiān)測大腦中動脈灌注區(qū)域腦血流，記錄梗死前腦血流的基礎(chǔ)值，插栓后腦血流的下降值及拔栓后腦血流的恢復值，從而進一步比較雌雄兩組之間的差異。正常生理條件下，雌性大鼠腦血流基礎(chǔ)值顯著低于雄性，單側(cè)MCAO缺血再灌過程中，雖然雌雄兩組腦血流和各自基礎(chǔ)值相比下降和恢復的程度差異無統(tǒng)計學意義，但雌性再灌注后腦血流量較基礎(chǔ)值的恢復要優(yōu)于雄性。此結(jié)果可能是由于雌激素可以改變血管的狀態(tài)，增加了一部分血流量，另外Dhandapani等［15］用雌二醇處理大鼠腦皮質(zhì)的星形膠質(zhì)細胞6 h至36 h發(fā)現(xiàn)可誘導釋放轉(zhuǎn)化生長因子，而轉(zhuǎn)化生長因子的增加在腦缺血時有保護作用，推測雌激素可以通過刺激星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化生長因子途徑在缺血性卒中時起到神經(jīng)保護作用。這雖然與腦血流恢復百分比差異無統(tǒng)計學意義，但最終的梗死體積差異卻有統(tǒng)計學意義。另外，我們還推測雌性大鼠腦血流基礎(chǔ)值較雄性基礎(chǔ)值更低的狀態(tài)可能提高其對缺血再灌注損傷的耐受性。綜上，我們推測性別因素中除了雌激素外，腦血流的差異也可能是導致腦梗死面積統(tǒng)計中雌性大鼠顯著低于雄性大鼠的原因。另有報道［16］稱雄激素亦具有神經(jīng)保護作用。但雌激素具有周期性，在實驗過程中，實驗人員無法準確計算雌激素水平，這就為雌性動物應用于腦血管病動物模型造成了一定的困難，不利于模型的穩(wěn)定，而雄激素的周期性并不明顯，對其他生理指標的影響也并不顯著，故雄性動物更適合于腦血管病的研究。

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