朱 祎，李家園，黃 俊，張清順，周宇江，侯建軍*

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六氯苯暴露導(dǎo)致梨形環(huán)棱螺脂質(zhì)過(guò)氧化及DNA損傷研究

朱 祎1,2，李家園1,2，黃 俊1,2，張清順1，周宇江1，侯建軍1,2*

(1 污染物分析與資源化技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435002；2 湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

采用暴露實(shí)驗(yàn)方法，研究了不同濃度HCB（分別為0.0、2 .0、4.0、8.0、16.0 mg/L）在不同暴露時(shí)間(0-14d)下對(duì)梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓中MDA、ROS含量以及DNA單鏈斷裂程度的影響。結(jié)果表明：HCB對(duì)梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓中MDA、ROS含量和DNA斷裂均有明顯影響。肝臟和鰓的MDA含量在HCB暴露過(guò)程中波動(dòng)升高，直到在第4天或第7天達(dá)到峰值，然后MDA含量持續(xù)下降，到第14天 時(shí)，除了16.0mg/L劑量組與對(duì)照組無(wú)顯著差異外，其他劑量組MDA仍處于顯著被誘導(dǎo)狀態(tài)。ROS水平隨暴露時(shí)間和劑量增加而表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，并且高劑量組較中低劑量組更早達(dá)到峰值，隨著暴露時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，各劑量組ROS含量均有一定程度的下降，但在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍然顯著高于對(duì)照組。各劑量組DNA在HCB暴露起始時(shí)，出現(xiàn)一定程度的單鏈斷裂現(xiàn)象，即F值迅速降低，隨后F值有所上升，在第4天時(shí)F值達(dá)到最高點(diǎn)，顯示DNA有一定程度的修復(fù)效應(yīng)。接著F值呈現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢(shì)，并且高劑量組的DNA單鏈斷裂明顯，表現(xiàn)出時(shí)間-劑量效應(yīng)。結(jié)果提示，上述生物標(biāo)志物在六氯苯對(duì)梨形環(huán)棱螺進(jìn)行毒性暴露過(guò)程中的變化較為敏感，可以作為指示六氯苯對(duì)梨形環(huán)棱螺毒理效應(yīng)的生物標(biāo)志物。

六氯苯；梨形環(huán)棱螺；丙二醛；活性氧自由基；DNA單鏈斷裂

0 前言

隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅猛發(fā)展，大量有機(jī)污染物源源不斷地進(jìn)入水體環(huán)境，使得水域環(huán)境污染日益嚴(yán)重。六氯苯(HCB)是一類(lèi)典型的持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants，POPs)，它具有高脂溶性、高致毒性、殘留持久性、長(zhǎng)距離遷移性和生物蓄積性等特點(diǎn)[1]，能在環(huán)境中持久殘留，不易生物降解；能通過(guò)食物鏈的富集作用對(duì)生物造成嚴(yán)重影響；也能夠經(jīng)過(guò)長(zhǎng)距離遷移到達(dá)遠(yuǎn)離污染源的地區(qū)，對(duì)接觸該物質(zhì)的生物造成損害[2]。梨形環(huán)棱螺屬于中腹足目(Mesogastropoda)，田螺科(Cipangopaludina)，環(huán)棱螺屬()，它在我國(guó)分布廣，數(shù)量多，易培養(yǎng)，繁殖快，是富營(yíng)養(yǎng)型湖泊的優(yōu)勢(shì)腹足類(lèi)種群[3]，也是大型底棲生物的重要組成部分。研究表明眾多環(huán)境污染物主要通過(guò)作用于線粒體而發(fā)揮其毒理效應(yīng)[4,5]。HCB在體內(nèi)代謝時(shí)，可通過(guò)氧化還原循環(huán)途徑產(chǎn)生多種中間代謝產(chǎn)物，并伴隨產(chǎn)生大量的活性氧自由基(如O2-，·OH，H2O2)[6]。HCB暴露還可通過(guò)誘導(dǎo)線粒體電子傳遞過(guò)程中電子漏的增加而增加活性氧的含量[7]。活性氧自由基若不及時(shí)被清除，就會(huì)誘發(fā)生物體內(nèi)DNA 斷裂、脂質(zhì)過(guò)氧化等損傷[6]。因而，這些生物標(biāo)志物的活性變化間接地反映了環(huán)境中氧化應(yīng)激的存在，可作為環(huán)境污染脅迫的指標(biāo)[8]。Peters等[9]認(rèn)為將抗氧化酶活性單獨(dú)作為污染引起氧化脅迫的生物標(biāo)志物，其特異性和靈敏性不足，還應(yīng)當(dāng)測(cè)定前氧化物（Pro-oxidant）損傷（脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA斷裂）。所以本研究選用梨形環(huán)棱螺作為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)暴露實(shí)驗(yàn)方法研究不同濃度HCB對(duì)梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)(MDA、ROS)、肝臟和鰓組織中DNA單鏈斷裂水平等毒理效應(yīng)，初步探討HCB對(duì)梨形環(huán)棱螺的的脂質(zhì)過(guò)氧化、遺傳損傷機(jī)理，為水環(huán)境POPs污染的早期診斷及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物梨形環(huán)棱螺（Heude) 采集于湖北省黃石市磁湖，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖。養(yǎng)殖池溫度保持在 20-25℃，pH值控制在7.5左右。每天交替投喂新鮮的植物葉子和配合飼料。

1.2 儀器試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備包括：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；DIAX900微量勻漿機(jī)(德國(guó)Heidolph公司)等；凝膠成像分析系統(tǒng)(SYDR/2033)；常規(guī)垂直與水平凝膠電泳儀；核酸蛋白測(cè)定儀(EPPENDORF AG)；熒光分光光度計(jì)（Shimadzu RF-5301PC）等。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

六氯苯(HCB)、蔗糖（Amresco）、Janus Green B (1%) (Fluka)、蛋白酶K、RNA酶、Hoechst dye 33258 (二苯丙咪唑)、二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、二甲基亞砜(DMSO)、標(biāo)準(zhǔn)DNA（上述藥品均購(gòu)自Sigma公司)，其余包括EDTA、Tris、β-巰基乙醇，戊二醛。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HCB在體毒物毒性暴露實(shí)驗(yàn)

在急性毒性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以二甲基亞砜(DMSO)作溶劑，確定和配制用于動(dòng)物在體暴露實(shí)驗(yàn)用的不同濃度的母液，DMSO在暴露實(shí)驗(yàn)溶液中的最終體積分?jǐn)?shù)為0.01%。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置如下：對(duì)照組(CK，不含HCB，與其他組含等量DMSO)，HCB暴露組分別為2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L 4個(gè)濃度組，以下簡(jiǎn)稱(chēng)2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L劑量組。挑選比較活躍、體重在1.5 g 左右的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)在38cm×28cm×15cm 的水箱內(nèi)進(jìn)行。溫度為24±1℃，自然光照，各梯度分別放入1.4—1.6 g健康、活動(dòng)性強(qiáng)的梨形環(huán)棱螺 60只，將實(shí)驗(yàn)螺進(jìn)行不同HCB濃度、不同時(shí)間的毒性暴露實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度梯度分別設(shè)置3個(gè)平行的水族箱。實(shí)驗(yàn)期間的管理與飼養(yǎng)繁殖期間一致，隔天換水一次，每次換水一半，換水時(shí)分別加入含有與HCB毒性暴露實(shí)驗(yàn)中濃度一致的曝氣自來(lái)水。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后分別于1d、2d、4d、7d、10d 和14d 取樣，在每個(gè)濃度梯度的水族箱中各隨機(jī)選取6只實(shí)驗(yàn)用螺，用紗布擦干螺的體表，置冰盤(pán)內(nèi)進(jìn)行解剖，分離其肝臟和鰓，用濾紙吸干，置于2.0 mL離心管內(nèi)，液氮速凍后于－80℃冰箱中保存?zhèn)錅y(cè)。

1.3.2 各類(lèi)生物標(biāo)志物的測(cè)定方法

（1）酶樣的制備

取肝、鰓組織約0. 1～0. 2 g，以1: 20 (質(zhì)量濃度)的比例加入預(yù)冷的0.01 mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液，冰水浴中低速勻漿，4℃下離心 (10000 g，10 min)，取上清液，即為組織酶提取液。

（2）MDA的測(cè)定

MDA的測(cè)定采用試劑盒(南京建成生物工程研究所，A003-1)，上述蛋白質(zhì)含量均采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定（南京建成生物工程研究所第一分所，A045-2）。

（3）ROS的測(cè)定

參照Curtin等的方法稍加改進(jìn)[10]。反應(yīng)體系為：1.95 mL線粒體液，加0.05 mL( 1 m mol·L-1) DCFH-DA，混勻，于37 ℃溫浴30 min，用熒光分光光度計(jì)(Ex＝485nm，Em＝538nm，狹縫＝1.5 nm)測(cè)其熒光強(qiáng)度( FI)值，單位以FI·mg-1蛋白表示。

（4）DNA完整性測(cè)定

按照堿解旋程序分析DNA的單鏈斷裂情況[11]，堿解旋后的DNA樣品中加入3 mL0. 2 mol.L-1磷酸鉀緩沖液(pH=6.9)，30μL Hoechst dye 33258 (二苯丙咪唑，0.1 g·L-1)，混勻后置于暗處反應(yīng)15 min 后，用熒光分光光度計(jì)在Ex: 360 nm，Em: 450nm 處測(cè)定吸光值。DNA完整性通常以F值表示，F(xiàn)值的計(jì)算公式如下[12]：

F =（XauDNA- XssDNA)/(dsDNA - XssDNA)

上式中，X為熒光值，dsDNA 為雙鏈DNA，ssDNA為單鏈DNA，auDNA為堿解旋后的DNA。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x ±s.）表示，全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 15. 0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，對(duì)照組與各劑量組的兩兩比較采用LSD法，抗氧化指標(biāo)間的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。繪圖軟件采用Sigmaplot13.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度HCB對(duì)梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓MDA含量的影響

圖1A顯示，各HCB劑量組其肝臟組織中MDA含量在暴露前2d內(nèi)經(jīng)歷了小幅度波動(dòng)，表現(xiàn)為先上升后下降；到第2d時(shí)，各劑量組又降至對(duì)照組附近（>0.05）；然后各組MDA的含量被再度誘導(dǎo)，顯著升高直至達(dá)到各自峰值，并且其最高值與各劑量呈負(fù)相關(guān)。此時(shí)，與對(duì)照組相比，MDA含量上升了180%－230%（<0.01）；隨后各組MDA含量受到抑制持續(xù)下降，至第14d時(shí)，中低劑量組的MDA含量比對(duì)照組高出100%－170%，但仍都處于極顯著誘導(dǎo)狀態(tài)（<0.01），而16.0 mg/L劑量組肝組織的MDA含量?jī)H略高于對(duì)照組（>0.05）。

在圖1B中，在HCB暴露的前2d，各劑量組鰓組織中MDA含量均被誘導(dǎo)升高；之后除16.0 mg/L劑量組的MDA含量存在些許波動(dòng)，其余各劑量組MDA含量均保持上升趨勢(shì)，直至達(dá)到各自的峰值。從圖中可以看出，2.0 mg/L劑量組達(dá)到峰值的時(shí)間最晚，但峰值最高，其上升率約達(dá)到對(duì)照組的240%；其中16.0 mg/L劑量組的峰值最低，僅比對(duì)照組高出120%，但各劑量組MDA含量均處于顯著誘導(dǎo)狀態(tài)（<0.01）。然后各劑量組MDA含量從峰值開(kāi)始下降，至第14d時(shí)中低劑量組的MDA含量約為對(duì)照組的128%－152%，仍顯著高于對(duì)照組（<0.05）；16.0 mg/L劑量組MDA含量也處于誘導(dǎo)狀態(tài)，但僅略高于照組（>0.05）。

2.2 不同濃度HCB對(duì)梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織線粒體中ROS含量的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各劑量組的肝臟線粒體中ROS含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),在HCB暴露的前階段，ROS含量呈劑量依賴(lài)性升高。HCB暴露的第1d，2.0 mg/L劑量組ROS含量?jī)H上升了15%，4.0mg/L劑量組ROS含量上升了28%（<0.05），8.0與16.0 mg/L劑量組已與對(duì)照組存在極顯著差異(<0.01)。之后，各劑量組ROS含量持續(xù)上升直至達(dá)到各自的峰值，此時(shí)各劑量組ROS含量均與對(duì)照組有顯著或極顯著差異，并且16.0 mg/L劑量組ROS含量已達(dá)到對(duì)照組的179%。隨著暴露時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，各劑量組的ROS含量都表現(xiàn)出一定程度的波動(dòng)，總體上均呈下降趨勢(shì)，到第14d時(shí)各劑量組仍然與對(duì)照組有顯著或極顯著的差異，并且其ROS含量與各劑量呈正相關(guān)(表1)。

表 1 HCB對(duì)梨形環(huán)棱螺肝臟中ROS含量的影響 (FI.mg-1)

* 處理組和對(duì)照組間差異顯著(<0.05) ; **差異極顯著(<0.01). 以下相同。

如表2，HCB對(duì)鰓線粒體中ROS含量影響趨勢(shì)與肝臟中極為相似，但誘導(dǎo)程度更加顯著。除了2.0 mg/L劑量組在暴露的第1d僅上升了20.4%（>0.05），其它各劑量組在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)ROS含量就顯著上升。隨后各劑量組ROS含量呈劑量依賴(lài)性上升直至達(dá)到各自的峰值，此時(shí)各劑量組ROS含量為對(duì)照組的167%~195%（<0.01）。達(dá)到峰值后，各劑量組的ROS含量均開(kāi)始一定程度的下降；在第10d-14d，ROS含量基本維持相對(duì)穩(wěn)定，其下降幅度不超過(guò)2%；到第14d時(shí)，各劑量組的ROS的上升率為對(duì)照組的55%~89%，極顯著高于對(duì)照組（<0.01）。

對(duì)于生產(chǎn)危險(xiǎn)化學(xué)品的特種化工過(guò)程，安全性應(yīng)放在首位。完全依賴(lài)人員經(jīng)驗(yàn)的傳統(tǒng)式安全防護(hù)技術(shù)，在工藝介質(zhì)危險(xiǎn)性大、工藝過(guò)程日趨復(fù)雜的形勢(shì)下，已不能很好地滿(mǎn)足特種化工過(guò)程的安全管控需要。隨著國(guó)內(nèi)外安全科學(xué)與工程技術(shù)的研究、發(fā)展和應(yīng)用的日益成熟，按照安全工程技術(shù)原理和方法對(duì)危險(xiǎn)的特種化工過(guò)程進(jìn)行安全管控，已逐步成為國(guó)內(nèi)外化工安全領(lǐng)域的通行做法[1-5]。

表2 HCB對(duì)梨形環(huán)棱螺鰓中ROS含量的影響 (FI.mg-1)

2.3 HCB對(duì)梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓中DNA單鏈斷裂的影響

表3顯示，在HCB暴露的第1 d各劑量組梨形環(huán)棱螺肝臟中DNA單鏈均呈現(xiàn)出一定程度的斷裂（(表現(xiàn)為F值均低于對(duì)照組），其斷裂程度呈劑量依賴(lài)性關(guān)系，其中高劑量組（16.0 mg/L）F值下降了43.4% (< 0.05)，其余各組DNA單鏈斷裂并不明顯。隨后F值均有一定程度的上升，提示斷裂的DNA有一定程度的修復(fù)。其中，低劑量組(2.0、4.0 mg/L)F值上升的幅度不超過(guò)8%，而高劑量組(8.0、16.0 mg/L組)F值上升的幅度在40%左右。隨著HCB暴露時(shí)間的進(jìn)一步的延長(zhǎng)，F(xiàn)值保持下降趨勢(shì)，直至第14 d。此時(shí)，高劑量組F值僅為對(duì)照組的42.5%~53.5% (< 0.05)，表明DNA單鏈斷裂顯著；而低劑量組與對(duì)照組相比僅下降了26%~41%（> 0.05）。

HCB脅迫對(duì)梨形環(huán)棱螺鰓DNA單鏈的影響趨勢(shì)與其在肝臟中較為一致但程度相對(duì)較小。在HCB暴露的第1d，各劑量組DNA單鏈均呈現(xiàn)一定程度的斷裂且其斷裂程度同樣呈劑量依賴(lài)性關(guān)系(表現(xiàn)為F值均低于對(duì)照組，且依次降低，見(jiàn)表4)，其中8.0、16.0mg/L劑量組與對(duì)照組相比下降了37%~41% (<0.05)。其余各組均與對(duì)照組無(wú)顯著差異。隨后，高劑量組(8.0、16.0mg/L)較低劑量組(2、4 mg/L)的F值有更大幅度的回升，回升后的F值與對(duì)照組均無(wú)顯著差異。隨著HCB暴露時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，各劑量組F值持續(xù)降低，顯示DNA單鏈斷裂程度繼續(xù)加重。此間，除了8.0mg/L劑量組在第14d，16.0mg/L劑量組在第7、10、14d和對(duì)照組相比有顯著差異外，其余各組在此階段與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異。至暴露到14d時(shí)，低劑量組(2, 4mg/L)的F值僅下降25%~27%(>0.05)，而高劑量組(8，16mg/L)F值則下降48%~63%(<0.05)。

表3 HCB對(duì)梨形環(huán)棱螺肝組織中DNA損傷的影響

* 處理組和對(duì)照組間差異顯著(<0.05) . 以下相同。

表4 HCB對(duì)梨形環(huán)棱螺鰓組織中DNA損傷的影響

3 討論

3.1 不同濃度HCB對(duì)梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織的脂質(zhì)過(guò)氧化效應(yīng)

采用HCB暴露時(shí)，生物體內(nèi)可產(chǎn)生大量活性氧自由基，當(dāng)產(chǎn)生的活性氧自由基不能被及時(shí)清除時(shí)，?？赡芡ㄟ^(guò)攻擊膜不飽和脂肪酸而引起脂質(zhì)過(guò)氧化，分解生成MDA等物質(zhì)，從而使生物大分子之間發(fā)生交聯(lián)，聚合而發(fā)生功能異常[13]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量可反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度[14]。本試驗(yàn)中，肝臟MDA含量在HCB暴露1~2d 時(shí)，其含量下降，可能是由于在短時(shí)間內(nèi)HCB脅迫誘導(dǎo)了抗氧化防御系統(tǒng)，活性氧被及時(shí)清除，機(jī)體免受氧化損傷。鰓中MDA自染毒開(kāi)始以及肝中MDA染毒2d后，MDA含量顯著持續(xù)上升直至各劑量組達(dá)到峰值，表明HCB已引起機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生氧化損傷，這是由于HCB持續(xù)脅迫，活性氧生成量超出抗氧化系統(tǒng)的清除能力，抗氧化防御系統(tǒng)正常功能發(fā)生紊亂，自由基不能被及時(shí)清除，大量積累，從而產(chǎn)生生物氧化脅迫作用，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致MDA含量升高。

另外，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，2.0 mg/L劑量組雖較晚達(dá)到峰值，但其峰值要高于其他劑量組，推測(cè)低濃度HCB長(zhǎng)期誘導(dǎo)亦可產(chǎn)生較大損傷。達(dá)到峰值后，各劑量組MDA含量持續(xù)下降，可能是抗氧化防御系統(tǒng)中多種成分參與了自由基的清除及GSH等與脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物MDA直接結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCB暴露對(duì)螺線粒體產(chǎn)生了氧化脅迫，而螺體存在有效的機(jī)制來(lái)減輕氧化損傷程度。隨著自由基的不斷生成，生物體發(fā)生氧化應(yīng)激來(lái)適應(yīng)逆境脅迫，這種平衡的改變會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的累積，而MDA本身又會(huì)加劇細(xì)胞的損傷，抑制抗氧化系統(tǒng)的活性[15]，所以本實(shí)驗(yàn)中，低劑量組MDA含量最終仍顯著高于對(duì)照組。16.0 mg/L劑量組MDA含量與對(duì)照組非常接近，可能是因?yàn)轶w內(nèi)某些抗氧化指標(biāo)的活性因代償性應(yīng)激反應(yīng)而不斷升高，繼而抗氧化能力逐漸提高，脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程受到抑制，導(dǎo)致其產(chǎn)物MDA含量減少。

3.2 不同濃度HCB導(dǎo)致梨形環(huán)棱螺氧化脅迫機(jī)理

ROS是細(xì)胞代謝不可避免的產(chǎn)物。近年來(lái)研究表明，ROS主要產(chǎn)生于線粒體的氧化呼吸過(guò)程中[16]。本實(shí)驗(yàn)中，采用HCB暴露后，ROS含量持續(xù)上升，并且高劑量組（8.0、16.0 mg/L）較中低劑量組（2.0、4.0 mg/L）更早達(dá)到峰值，表明ROS含量同時(shí)受到HCB暴露時(shí)間和暴露濃度的影響，表現(xiàn)出時(shí)間－劑量效應(yīng)特征。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和前文討論，結(jié)合Sashwati等的報(bào)道[17]，我們推測(cè)，六氯苯暴露可誘導(dǎo)梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓線粒體中抗氧化酶活性顯著增加，而線粒體中單加氧酶活性被顯著抑制，因此HCB暴露可能導(dǎo)致線粒體電子傳遞過(guò)程中的電子泄露增加，漏出呼吸鏈的電子未能用于ATP 合成，而是參加了超氧自由基的產(chǎn)生和代謝，即引起氧單電子還原而產(chǎn)生超氧陰離子自由基[7]，所以導(dǎo)致ROS等自由基大量產(chǎn)生。另外，HCB在螺體內(nèi)代謝時(shí)可進(jìn)行氧化還原循環(huán)，同樣也伴隨著活性氧自由基大量產(chǎn)生[6]。HCB導(dǎo)致ROS大量生成的同時(shí)，會(huì)引起機(jī)體的氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)SOD等抗氧化酶活性增強(qiáng)，ROS被大量清除，導(dǎo)致其含量迅速降至正常水平或略低于正常值。但隨著暴露時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，進(jìn)入體內(nèi)的HCB增多，誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)量活性氧，而消除活性氧的抗氧化酶系統(tǒng)的協(xié)調(diào)性遭到破壞，進(jìn)而引起活性氧大量積累。此現(xiàn)象與實(shí)驗(yàn)后期“ROS含量雖有一定程度的下降，但與對(duì)照組有顯著或極顯著差異”這一結(jié)果相吻合。另外，過(guò)多的電子泄漏會(huì)導(dǎo)致氧自由基代謝失衡，并產(chǎn)生較多的活性氧，進(jìn)而引起線粒體突變、損傷[18]，氧化磷酸化系統(tǒng)受損會(huì)影響與呼吸鏈有關(guān)的酶的活性，導(dǎo)致經(jīng)電子漏生成的O2-會(huì)顯著增多，使線粒體ROS過(guò)量產(chǎn)生，此時(shí)抗氧化酶的活性并沒(méi)有太大改變[19]，過(guò)量ROS不能被完全清除而最終明顯高于對(duì)照組，最終導(dǎo)致機(jī)體遭受?chē)?yán)重的過(guò)氧化脅迫。

3.3 HCB導(dǎo)致梨形環(huán)棱螺遺傳損傷機(jī)理

DNA單鏈斷裂是一種重要的DNA損傷。本實(shí)驗(yàn)采用堿解旋法檢測(cè)了暴露于HCB后梨形環(huán)棱螺肝臟和鰓組織中DNA的單鏈斷裂程度。由于HCB進(jìn)入螺體內(nèi)后，在代謝過(guò)程中可形成多種中間代謝物，這些中間代謝產(chǎn)物多為活性極高的親電化合物，可與DNA分子反應(yīng)形成DNA加合物，從而誘導(dǎo)多種類(lèi)型的遺傳損傷如DNA單鏈的斷裂[20]；另外，HCB暴露導(dǎo)致活性氧積累，同樣可以也可引起DNA單鏈斷裂。本實(shí)驗(yàn)在暴露的第1d內(nèi)，就在各劑量組檢測(cè)到了DNA單鏈斷裂現(xiàn)象。由于體內(nèi)存在有GST等解毒酶，可通過(guò)催化GSH與親電中間代謝物結(jié)合，減少DNA加合物形成的可能性，因此斷裂的DNA會(huì)出現(xiàn)一定程度的修復(fù)，從而減輕了DNA的損傷程度[21]。當(dāng)HCB暴露時(shí)間延長(zhǎng)，ROS進(jìn)一步增加，SOD等抗氧化酶活性降低，氧自由基積累，過(guò)量積累的ROS不能被及時(shí)清除，將導(dǎo)致螺體鰓和肝臟組織的氧化損傷和自由基介導(dǎo)的過(guò)氧化作用加劇，氧化損傷產(chǎn)物增加又會(huì)進(jìn)一步削弱抗氧化酶系修復(fù)損傷的緩沖能力[22]；產(chǎn)生的過(guò)量活性氧可以直接攻擊DNA，引起細(xì)胞的氧化性損傷[23]。本實(shí)驗(yàn)中的F值持續(xù)下降，直至第14d；隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，高劑量組（8.0、16.0mg/L）較中、低劑量組（2.0、4.0 mg/L）F值的下降幅度更大，提示DNA單鏈同時(shí)受到暴露時(shí)間和暴露濃度的影響。

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Exposure to Hexachlorobenzene in Bellamya purificata Inducing Lipid Peroxidation and DNA Damage

ZHU Yi1,2, LI Jia-yuan1,2, HUANG Jun1,2, ZHANG Qing-shun1, ZHOU Yu-jiang2, HOU Jian-jun1,2

(1 Hubei Key Laboratory of Pollutant Analysis & Reuse Technology, Huangshi Hubei 435002, China; 2 College of Life Science, Hubei Normal University, Huangshi Hubei 435002, China)

An exposure experiment was conducted to study the effects of HCB at different concentrations (0, 2.0, 4.0, 8.0, 16.0 mg / L) on levels of MDA and ROS as well as the extent of DNA single-strand breaks in liver and gills of Bellamya purificata at different exposure time (0-14d) in vivo. The results showed that HCB had significant influence on them.The concentrations of MDA increased fluctuatly during exposure of HCB until they reached peak value on 4th day or 7th day, and then they decreased on 14th day. There was significant difference between HCB exposure and the control group except 16.0 mg/L HCB group. The concentration of ROS tended to be enhanced with the exposure time and dosage increasing, ROS of high dosage group reached its peak earlier than that of low dosage. The content of ROS decreased in a certain extent with the exposure time further increasing, and they were still significantly higher than that of control group on 14th day. DNA single-strand breaking of each HCB group occurred in a way at the beginning of exposure，that was the F value decreased quickly, and then increased slightly till it reached an upper value on 4th day, which indicated that there were some recovering of the breaking DNA. Subsequently, F value of all HCB groups keeped decreasing, and more breaking appeared in high-dose-HCB groups. There was a time-dosage effect between the HCB exposure and DNA single-strand breaking. All these results suggested that biomarkers in this study were sensitive during HCB exposuring, which could be used as biomarkers of evaluating toxicological effects of HCB on B. purificata.

Hexachlorobenzene; Bellamya Purificata; Malonyldialdehyde; Reactive Oxygen Species; DNA Single-Strand Breaks

X17

A

2095－414X(2013)03－0088－07

湖北省教育廳2010年度重點(diǎn)項(xiàng)目（No.D20102505），湖北師范學(xué)院2008年度人才項(xiàng)目(No.2008F14)，污染物分析與資源化技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(No.KY2013G11)，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水生態(tài)與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(No.2007FEA0205），中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院內(nèi)陸漁業(yè)生態(tài)環(huán)境和資源重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（No. YM2007－03）.

侯建軍（1966-），男，教授，博士，研究方向：水域生態(tài)學(xué)及分子生態(tài)毒理學(xué).