田 偉，畢玉婷，周啟龍，薛艷紅，仇 敏，但飛君，劉士平

三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，宜昌 443002

神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷會(huì)造成多種退行性疾病，如帕金森癥(PD)、阿爾茨海默病(AD)和亨廷頓氏病(HD)等［1］。保護(hù)神經(jīng)元免受氧化脅迫，在氧化應(yīng)激的代謝途徑中尋找合適的抗氧化劑，是防治這類疾病的有效手段之一［2，3］。沒(méi)食子酸(gallic acid，GA，3，4，5-三羥基苯甲酸)，是一種抗氧化活性較高的天然產(chǎn)物，可清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基，但由于其有強(qiáng)刺激性和細(xì)胞毒性，油溶性差，所以在臨床上常用其酯類作為抗氧化劑［4］。如沒(méi)食子酸丙酯(Propyl gallate，PG)能有效防護(hù)脂氧化作用對(duì)細(xì)胞的損傷，對(duì)細(xì)胞的毒副作用很小，是美國(guó)、歐盟和世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)使用的抗氧化劑［4］。本文從三峽流域特有瀕危植物疏花水柏枝(Myricaria laxiflora)［5］中分離到一種3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯(沒(méi)食子酸甲酯的衍生物，以下簡(jiǎn)稱二甲氧酯)，建立了過(guò)氧化氫對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的氧化損傷模型，比較了它與沒(méi)食子酸乙酯、沒(méi)食子酸正丙酯、沒(méi)食子酸異戊酯，沒(méi)食子酸正辛酯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，探討了其細(xì)胞毒性的差異，以期為新型神經(jīng)退行性疾病藥物的開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)中使用的試劑有:D-MEM/F-12完全培養(yǎng)基(內(nèi)含2.2 mg/mL NaHCO3，100 U/mL青霉素，100 μg/mL 鏈霉素，10% 新生小牛血清)，D-MEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(內(nèi)含3%新生小牛血清)，胰蛋白酶(美國(guó)GIBCO公司)，四氮唑藍(lán)(MTT，美國(guó)AMRESCO公司)，過(guò)氧化氫(H2O2，國(guó)藥集團(tuán)西安公司)。試劑均為分析純。

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心惠贈(zèng)。沒(méi)食子酸酯系列化合物(沒(méi)食子酸乙酯、沒(méi)食子酸正丙酯、沒(méi)食子酸異戊酯、沒(méi)食子酸正辛酯)均通過(guò)有機(jī)合成方法獲得(樣品純度均達(dá)到99%以上)，來(lái)自于三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院但飛君教授實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)驗(yàn)所需儀器主要有酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Genios Tecan)，核磁共振儀(UltrashiedTM，Bruker)，CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)，LD4-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，96孔板(美國(guó)Corning公司)。

1.2 3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯的分離與鑒定

取干燥的疏花水柏枝研磨成粉末，用95%乙醇回流提取，提取液減壓濃縮得總浸膏?？偨嘤眠m量4%HCl冷浸，酸水液用飽和Na2CO3依次調(diào)pH至7、10、12，分別用氯仿萃取，濃縮得不同pH條件下的提取物和沉淀。其中pH7條件下的提取物，經(jīng)氯仿、甲醇梯度洗脫硅膠柱層析及Sephadex LH-20、制備薄層法(PTLC)、重結(jié)晶等技術(shù)手段分離1個(gè)單體化合物，經(jīng)1H NMR、13C NMR鑒定為3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯，分子式為C10H12O。

1.3 沒(méi)食子酸酯系列藥物溶液的制備

分別取3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯、沒(méi)食子酸乙酯、沒(méi)食子酸正丙酯、沒(méi)食子酸異戊酯、沒(méi)食子酸正辛酯5 mg，置于EP管中，各加入50 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解后，再加入450 μL無(wú)水乙醇，配成終濃度為10 mg/mL的藥物溶液備用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞用D-MEM/F-12完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每2 d換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞80% ～90%鋪滿瓶底時(shí)進(jìn)行傳代、轉(zhuǎn)板。在傳代時(shí)，倒掉舊培養(yǎng)基后，先用PBS緩沖液將細(xì)胞清洗，再用0.25%的胰蛋白酶置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行干消化約40 s，離心后按1∶3比例進(jìn)行傳代［7］。

1.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

為評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞的毒害作用并確定最適給藥濃度，我們用MTT法評(píng)價(jià)了不同藥物的細(xì)胞毒性。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞稀釋后，接種于96孔板中，待神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，加入濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL 的各種藥物，加藥量為100 μL/孔。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入100 μL含0.5 mg/mL MTT的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，輕輕振搖96孔板使甲瓚顆粒充分溶解，用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率(存活率=處理組OD值/空白組OD值×100% ，下同)［8］。

1.6 H2O2氧化損傷模型的建立

神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，加入不同濃度(400、600、800、1000 μmol/L)的 H2O2溶液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋而成)，空白對(duì)照組只加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后用MTT法測(cè)吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。選取50%～60%細(xì)胞死亡的H2O2濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)［9］。

1.7 沒(méi)食子酸酯系列藥物的篩選及量效關(guān)系分析

SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)進(jìn)行預(yù)給藥，分別加入濃度梯度為 25、12.5、6.25、3.125、1.0625 μg/mL的沒(méi)食子酸酯類化合物(基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制而成)，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，模型組加入濃度為800 μmol/L的H2O2溶液，給藥組加入相應(yīng)濃度的藥物及濃度為800 μmol/L的H2O2溶液，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后用MTT法測(cè)吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率［10］。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯的分離與鑒定

疏花水柏枝(Myricaria laxiflora)是一種分布在三峽河岸帶地區(qū)的珍稀民間藥材，當(dāng)?shù)厝顺Ｓ脕?lái)治療風(fēng)濕、燙傷等疾病。本實(shí)驗(yàn)用干燥的疏花水柏枝粉末，經(jīng)回流提取、減壓濃縮后，在pH7條件下經(jīng)柱層析、重結(jié)晶分離到1個(gè)單體化合物。該物質(zhì)為淡黃色粉末，1H NMR(CD3OD-d4，400 MHz)δ:7.16(d，J=1.6 Hz，1H ，H-2)，，7.15(d，J=1.6 Hz，1H，H-6)，3.87(s，3H，3-OCH3)，3.86(s，3H，4-OCH3)，3.84(s，3H，8-OCH3);13C NMR(CD3OD-d4，100 MHz)δ:126.5(C-1)，111.9(C-2)，151.6(C-3)，142.0(C-4)，154.4(C-5)，105.9(C-6)，168.3(C-7)，51.9(C-8)，55.8(C-9)，59.9(C-10)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)對(duì)照一致［6］，故鑒定為3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯，分子式為C10H12O5。

圖1 3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of 3，4-dimethoxy-5-hydroxy benzoic acid methyl ester

2.2 H2O2氧化損傷模型的建立

為明確沒(méi)食子酸酯類物質(zhì)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用，我們先構(gòu)建了H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷模型。結(jié)果顯示隨著H2O2濃度的增加，SH-SY5Y細(xì)胞的損傷作用越明顯，細(xì)胞存活率逐漸降低。800 μmol/L H2O2能導(dǎo)致約60%的SH-SY5Y細(xì)胞死亡(存活率41.6%)，因此選用此濃度的H2O2建立了穩(wěn)定的氧化損傷模型(圖2、圖4)。

圖2 H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響，＊＊ P＜0.01，n=5。Fig.2 Influence of H2O2concentrations on viability rate of SH-SY5Y cells，＊＊ P ＜0.01，n=5.

2.3 沒(méi)食子酸酯系列化合物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)

由于沒(méi)食子酸酯系列化合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有潛在的毒性，試驗(yàn)中我們考察了這些不同濃度的單體對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果顯示(表1)二甲氧酯、沒(méi)食子酸正丙酯和沒(méi)食子酸異戊酯在較低濃度(6.25 μg/mL)時(shí)可促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)，其它沒(méi)食子酸酯化合物隨著濃度的增加，對(duì)SHSY5Y細(xì)胞的毒害作用加強(qiáng)。在0～25 μg/mL濃度范圍內(nèi)，沒(méi)食子酸酯系列化合物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒害作用較小，選用此濃度范圍進(jìn)行沒(méi)食子酸酯系列化合物抗氧化保護(hù)作用分析。

表1 沒(méi)食子酸酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用Table 1 Influence of gallate esters on growth of SH-SY5Y cells

2.4 沒(méi)食子酸酯抗氧化保護(hù)作用分析

為了探究沒(méi)食子酸酯系列化合物對(duì)雙氧水所致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，本文特采用空白組，模型組，給藥組三種處理方式，給藥組加入不同濃度梯度(1.063、3.125、6.25、12.5 和 25 μg/mL)的沒(méi)食子酸酯類。將三種處理方式的OD492進(jìn)行比較，分析沒(méi)食子酸酯系列化合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用(圖3和4)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二甲氧酯、沒(méi)食子酸乙酯、正丙酯、異戊酯加藥后，細(xì)胞存活率有明顯提升，說(shuō)明對(duì)神經(jīng)細(xì)胞都有顯著的抗氧化保護(hù)作用，可以將皺縮的細(xì)胞恢復(fù)成近伸展的狀態(tài)，而沒(méi)食子酸正辛酯對(duì)雙氧水所致SH-SY5Y細(xì)胞損害的保護(hù)作用并不明顯(圖3、圖4)。另外，不是所有的抗氧化保護(hù)作用都有濃度依賴性，其中二甲氧酯和沒(méi)食子酸乙酯的最適濃度為為6.25 μg/mL，但是神經(jīng)細(xì)胞卻對(duì)沒(méi)食子酸丙酯和異戊酯的濃度顯得并不敏感。尤其需要指出的是，與廣泛使用的抗氧化劑沒(méi)食子酸正丙酯相比較，二甲氧酯和沒(méi)食子酸乙酯的保護(hù)作用也相當(dāng)突出，表明其可作為潛在的抗氧化劑而廣泛使用。

圖3 沒(méi)食子酸酯類化合物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷保護(hù)作用Fig.3 Oxidative damage protection of gallate esters to SH-SY5Y cells

圖4 過(guò)氧化氫致SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷及沒(méi)食子酸酯類化合物的保護(hù)作用(×200)Fig.4 Oxidation injury induced by H2O2and theprotection effects of gallate esters to nerve cells(×200)

3 討論

在許多退化性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，都涉及到活性氧能誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，因此保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激損傷，是防治該類疾病的有效手段之一。目前，治療神經(jīng)退行性疾病的主要臨床藥物大多為生物堿類結(jié)構(gòu)，本文在構(gòu)建了過(guò)氧化氫對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型后，探討了不同沒(méi)食子酸酯類的抗氧化保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大多沒(méi)食子酸酯類都對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有一定的抗氧化保護(hù)作用，為神經(jīng)退行性疾病的藥物設(shè)計(jì)提供了一定的參考價(jià)值。

由于沒(méi)食子酸正丙酯是一種廣泛使用的抗氧化劑，此外它還有有抗血小板聚集、抗炎、逆轉(zhuǎn)恢復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞等作用，在醫(yī)藥和食品工業(yè)中得到極大的關(guān)注。然而本文從三峽流域特有瀕危植物疏花水柏枝中分離到的一種天然產(chǎn)物，即3，4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯，為沒(méi)食子酸甲酯的衍生物，卻對(duì)神經(jīng)細(xì)胞顯示出比沒(méi)食子酸正丙酯更好的抗氧化保護(hù)作用，表明其有潛在的藥用價(jià)值。

但是沒(méi)食子酸正辛酯有點(diǎn)例外，與實(shí)驗(yàn)中所用的其他沒(méi)食子酸酯類相比，其抗氧化保護(hù)作用很小，可能與其本生的毒性作用較大有關(guān)，因此是否由于其參與成酯的烴基較大，影響了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，從而降低了它的抗氧化作用，這有待于進(jìn)一步研究。

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