舒孝順，卿婉華，許凱揚(yáng)，蔣方兵，劉瑞興

長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，長沙 410004

紅腺忍冬［1，2］(Lonicera japonica)為忍冬科植物，是我國常用中藥，具有清熱解毒、抗菌消炎、保肝利膽的功能。常以干燥花蕾或初花入藥。列在2005年版中國藥典“山銀花”項(xiàng)下，紅腺忍冬資源豐富，主產(chǎn)于河南、山東、云南及廣西等地，是山銀花藥材商品的主要來源之一。長期以來，紅腺忍冬山銀花花蕾和初花一方面大量入藥，另一方面還作為提取酚酸類化合物的工業(yè)原料?；瘜W(xué)和藥理研究證實(shí)［3，4］其主要化學(xué)成分有揮發(fā)油類、酚酸類、黃酮類和苷類，藥理作用主要有抗菌、抗病毒、解熱和抗氧化，酚酸類化合物(CHA)是紅腺忍冬山銀花花蕾和初花的主要有效成分，包括綠原酸、異綠原酸和咖啡酸等成份，但品種與產(chǎn)地不同而不同，因此山銀花中綠原酸含量的高低，是其質(zhì)量優(yōu)劣的重要標(biāo)志。

目前，提取金銀花及山銀花等植物中綠原酸的報(bào)道較多［5-8］，但有關(guān)紅腺忍冬花中綠原酸的研究報(bào)道幾乎沒有，更無有關(guān)提取方法及工藝優(yōu)選報(bào)道，本研究采用溶劑浸提法中的回流醇提法，相比其他方法更適合于中試及工業(yè)生產(chǎn)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選紅腺忍冬花綠原酸的最佳提取工藝，旨在為紅腺忍冬花及酚總酸類物質(zhì)的醫(yī)藥及保健食品開發(fā)利用提供參考，為紅腺忍冬花綠原酸的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

乙醇回流提取裝置，高速萬能粉碎機(jī):FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司;紫外可見分光光度計(jì):UV754型，上海精密科學(xué)儀器有限公司;電子天平:AY220型，SHIMADZU CORPORATION JAPAN。實(shí)驗(yàn)用水:蒸餾水;對(duì)照品綠原酸(批號(hào)110754)為中國藥品生物制品檢定所提供。95%工業(yè)乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

紅腺忍冬山銀花于2012年采自湖南(野生)，經(jīng)舒孝順教授鑒定為紅腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.，藥材于 60℃烘干，粉碎，過 60目篩，再于60℃烘至恒重，置干燥器中作供試品備用。

1.3 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取綠原酸對(duì)照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加70%乙醇適量，使其完全溶解并稀釋至刻度。搖勻，然后用移液管吸取7.5 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，加70%乙醇至刻度線，制成15 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于冰箱中避光保存。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定［7］

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，置10 mL量瓶中，再加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，在分光光度計(jì)上于200～400 nm掃描。對(duì)照品溶液與供試品溶液在329 nm處均有最大吸收。故將329 nm作為測(cè)定波長。精密量取對(duì)照品溶液1、2、3、5、7、9、10 mL 于10 mL 容量瓶，用70%乙醇定容，搖勻。以70%乙醇作參比液，在329 nm處測(cè)定其吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 綠原酸的提取與測(cè)定

稱取5.000 g紅腺忍冬山銀花，一定量的溶劑于圓底燒瓶中，以料液比1∶6～1∶14，50% ～90%乙醇為提取液在80℃下進(jìn)行回流提取，抽濾，濾液置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，搖勻。取此樣品液0.5 mL置于10 mL比色管中，然后按1.4方法測(cè)定溶液的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品綠原酸的平均含量，再計(jì)算相應(yīng)提取率。

1.6 單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)

對(duì)影響乙醇回流提取的5個(gè)因素(溶劑乙醇濃度、溶劑體積、溶劑pH、提取時(shí)間、提取次數(shù))，設(shè)計(jì)5個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，藥材用量5 g，所有實(shí)驗(yàn)都在80℃下進(jìn)行，通過比較提取率確定對(duì)提取率影響較大的4個(gè)因素再進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

以綠原酸樣品的濃度為橫坐標(biāo)，以在329 nm下測(cè)得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為:Y=0.0608X-0.0056，R=0.9998。結(jié)果表明，綠原酸在1.50～15 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度

準(zhǔn)確稱取5份(5.0000 g)紅腺忍冬山銀花粉末，分別取體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%乙醇各100 mL，調(diào)pH至3，在80℃水浴鍋中回流提取2 h，提取2次，趁熱過濾，合并兩次濾液，冷卻后，按照1.5的方法計(jì)算綠原酸含量，并計(jì)算相應(yīng)提取率。得到乙醇濃度和綠原酸提取率之間的關(guān)系圖(見圖1)。由圖可以看出，當(dāng)乙醇濃度低于70%時(shí)，綠原酸的提取率隨著乙醇濃度的升高而顯著增大，乙醇濃度為70%時(shí)達(dá)到最大，之后隨著乙醇濃度的進(jìn)一步增大提取率反而減小，可能在較高濃度乙醇中，綠原酸溶解度逐步減小。因此選擇70%乙醇為提取溶劑。

圖1 溶劑濃度對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction rate

2.2.2 料液比對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份(5.0000 g)紅腺忍冬山銀花粉末，分別取料液比為 6、8、10、12、14 倍體積的 70%乙醇，調(diào)pH至3，在80℃水浴鍋中回流提取2 h，提取2次，趁熱過濾，合并兩次濾液，冷卻后，按照1.5的方法計(jì)算綠原酸含量，并計(jì)算相應(yīng)提取率。得到料液比和綠原酸提取率之間的關(guān)系圖(見圖2)。由圖可以看出當(dāng)溶劑體積倍數(shù)達(dá)到10倍后，隨著溶液體積的增大，提取率增加量少且緩慢，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，選擇料液比1∶10。

圖2 溶劑體積對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of material-solvent ratio on extraction rate

2.2.3 溶劑pH對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份(5.0000 g)紅腺忍冬山銀花粉末，分別取pH 值調(diào)為2、3、4、5、6的70%乙醇各100 mL，在80℃水浴鍋中回流提取2 h，提取2次，趁熱過濾，合并兩次濾液，冷卻后，按照1.5的方法計(jì)算綠原酸含量，并計(jì)算相應(yīng)提取率。得到溶劑pH和綠原酸提取率之間的關(guān)系圖(見圖3)。由圖可以看出，隨著溶劑pH升高，綠原酸的提取率上升，在pH4時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，pH繼續(xù)升高提取率開始下降，這可能是由于部分綠原酸在較高pH環(huán)境下發(fā)生降解，故選擇pH4。

圖3 溶劑pH對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of solvent pH on extraction rate

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份(5.0000 g)紅腺忍冬山銀花粉末，分別取pH值為4的70%乙醇100 mL 5份，在80 ℃水浴鍋中分別回流提取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，提取2次，趁熱過濾，合并兩次濾液，冷卻后，按照1.5的方法計(jì)算綠原酸含量，并計(jì)算相應(yīng)提取率。得到提起時(shí)間和綠原酸提取率之間的關(guān)系圖(見圖4)。由圖可以看出，在1～2 h內(nèi)，綠原酸提取率隨時(shí)間增加不斷增長，在2.0 h達(dá)到最大值，此時(shí)綠原酸基本上已完全提取，由于綠原酸對(duì)溫度敏感，長時(shí)間在較高溫度不穩(wěn)定易降解，同時(shí)從生產(chǎn)周期方面考慮，實(shí)驗(yàn)選擇提取時(shí)間為2 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction duration on extraction rate

2.2.5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份(5.0000 g)紅腺忍冬山銀花粉末，取pH值為4的70%乙醇100 mL 5份，在80℃水浴鍋回流提取2次，每次分別提取1、2、3、4、5次，趁熱過濾，合并兩次濾液，冷卻后，按照1.5的方法計(jì)算綠原酸含量，并計(jì)算相應(yīng)提取率。得到提起次數(shù)和綠原酸提取率之間的關(guān)系圖(見圖5)。由圖可以比較得出，當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，提取率基本上達(dá)到最大，繼續(xù)增加提取次數(shù)，綠原酸的提取率基本維持不變，為簡化提取工藝，縮短生產(chǎn)周期，選擇綠原酸的最佳提取次數(shù)為2次。

圖5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of times of extraction on extraction rate

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

2.3.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)綠原酸的理化性質(zhì)、生產(chǎn)實(shí)際及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、回流時(shí)間(C)及提取次數(shù)(D)4個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以紅腺忍冬山銀花乙醇提取物中綠原酸含量及提取率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化提取條件。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 綠原酸提取正交實(shí)驗(yàn)表Table 2 L9(34)orthogonal experimental result

由表2直觀分析可得:四個(gè)因素對(duì)綠原酸提取率影響的顯著性依次為D＞A＞B＞C，即對(duì)綠原酸提取率的主次影響為:提取次數(shù)＞乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間，最佳提取工藝條件為A2B3C1D2，即乙醇濃70%，回流時(shí)間為2 h，料液比1∶10，其提取率為4.85%。

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

精密稱取5.0000 g紅腺忍冬山銀花粉末，按最佳提取方案A2B3C1D2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值，結(jié)果得到綠原酸平均提取率為4.81%。

3 結(jié)論

通過正交實(shí)驗(yàn)L9(34)驗(yàn)證，確定了紅腺忍冬山銀花中綠原酸最佳提取工藝條件為:乙醇濃度70%，回流時(shí)間為2.0 h，料液比1∶10，提取2次，回流溫度80℃，在最佳的提取工藝條件下測(cè)得紅腺忍冬山銀花中綠原酸提取率為4.85%，本研究對(duì)推動(dòng)我國紅腺忍冬花綠原酸的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展有著積極的意義。

本實(shí)驗(yàn)通過分光光度法測(cè)定紅腺忍冬山銀花中綠原酸含量及提取率，選擇最佳提取工藝條件，為紅腺忍冬花綠原酸在藥品及保健食品方面的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)，此方法準(zhǔn)確度較高，操作簡便，安全可靠。

1 Chinese Pharmacopoeia(國家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People's Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science and technology Press，2010.Vol I，28.

2 Yang YQ(楊玉琴)，Zhang LY(張麗艷)，Gao YM(高言明)，et al.Quality comparison of Lonicera fulvotomentosa in Guizhou and Lonicera hypoglauca in other places in China.Centrl South Pharm(中南藥學(xué))，2006，4:182-184.

3 Li SY(粟時(shí)穎)，Zheng X(鄭興)，Liao DF(廖端芳).Research progress on shanyinhua.J Univ South China，Med Ed(南華大學(xué)學(xué)報(bào)，醫(yī)學(xué)版)，2009，37:744-746.

4 Xing H(辛華)，Shan YM(單義曼)，Wang LP(王柳萍).Determination of effective components in Lonicera Hypoglauca Miq.grown in Guangxi.J Guangxi Tradit Chin Med Univ(廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào))，2012，15:51-53.

5 Ma F(馬烽)，Zhu YL(朱亞玲)，Chen MH(陳明輝)，et al.Research progress on extraction process of chlorogenic acid from Flos Lonicerae.Food Res Dev(食品研究與開發(fā))，2010，31:164-166.

6 Lin YL(林云良)，Sun QL(孫慶雷)，Zhu H(祝賀).Parameter optimization for ultrasonic extraction of chorogenic acid from Flos Lonicerae.Shandong Sci(山東科學(xué))，2008，21:26-28.

7 Chen W(陳文).Research on selecting the best extraction methods of chlorogenic acid in stems and leaves of L．confusa DC.J Chengdu Med Coll(成都中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào))，2011，6:46-48.

8 Ma BL(馬柏林)，Liang SF(梁淑芳).Progress report on extraction and separation of chlorogenic acid from Eucomia ulmoides．Shanxi Fore Sci Tech(陜西林業(yè)科技)，2003，21(4):74-79.