黃 靜，李 忠，馮 文，郭生云，施紅林

云南煙草科學(xué)研究院，昆明 650106

蓮霧(Syzygium．Samarangense(Bl.)Merr.et Perry)，桃金娘科蒲桃屬的常綠小喬木。又名天桃、輦霧、璉霧、爪哇浦桃。原產(chǎn)于馬來半島，在馬來西亞、印尼、菲律賓、臺灣、廣東、福建南部及廣西普遍栽培。性喜溫暖怕寒冷，生長最適氣溫為25～30℃，喜好濕潤的肥沃土壤，蓮霧性味甘平，功能潤肺、止咳、除痰、涼血、收斂［1］。

柚子(Citrus grandis(Linn.)Osbeck)，蕓香科柑橘亞科柑橘屬常綠果樹，花白色，果實大，果味酸，其花、葉、果皮均可提取芳香油。柚子葉具有清新的芳樟醇和乙酸芳樟酯的香氣，廣泛用于香水、花露水以及化妝品和香皂的加香。我國柚子種植面積很大，南方各省均有大面積種植，但幾乎沒有進行柚子葉精油的開發(fā)利用，造成資源的大量浪費［2］。

植物的葉片是光合作用的場所，也是整株植物生長發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)的重要“源庫”［3］。植物葉片在不同生理期所累計的各種蛋白質(zhì)、糖分以及有機物等有很大的區(qū)別，不同時期的葉片積累物質(zhì)由于植物生理需求的不同而產(chǎn)生變化，相應(yīng)的植物葉片提取物的揮發(fā)性成分也發(fā)生變化。對蓮霧和柚子不同生理期葉片揮發(fā)性成分差異的研究國內(nèi)未見報道。本研究采用高分辨質(zhì)譜HRMS以及多維數(shù)理統(tǒng)計方法對不同時期采集的柚子葉和蓮霧葉片的揮發(fā)性成分進行分析，多維數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用EZinfo 2.0軟件［4］(Umetrics公司)進行處理，其可通過簡單的操作界面將復(fù)雜數(shù)據(jù)按規(guī)定的方式給出可判斷的多元數(shù)據(jù)分析結(jié)果，對實驗植物樣品生理期的差異對其揮發(fā)性成分的影響進行初步探討。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

儀器:美國Waters公司GCT飛行時間質(zhì)譜;試劑:二氯甲烷為色譜純，水為去離子水;材料:陰干的蓮霧葉片與柚子葉片，采自西雙版納，品種經(jīng)由云南熱帶植物研究所劉昌芬研究院鑒定確認(rèn)。

1.2 分析條件

質(zhì)譜參數(shù):接口溫度為220℃;離子源溫度為220℃;電離方式為EI+;電子能量為70 eV;掃描范圍為40～400u。

色譜參數(shù):氣相色譜條件。色譜柱為PE-35MS(30 m × 0.32 mm，0.25 μm);進樣口溫度為250℃;載氣為高純氦氣，流速為1.5 mL/min;分流比為20∶1;程序升溫:初始溫度50℃，維持10 min，然后以10℃/min的速率升至250℃，維持10 min。

1.3 實驗方法

樣品處理:樣品為初生2個月蓮霧新葉和柚子新葉，初生8個月的蓮霧老葉與柚子老葉;共四個樣品，分別在種植基地上經(jīng)由5個采集點采摘，分別混合均勻，經(jīng)陰干脫水后，各取20 g樣品，用同時蒸餾萃取法提取，溶劑為二氯甲烷，蒸餾產(chǎn)物用定量濃縮儀濃縮至1 mL。

進樣方法:共四個樣品，每個樣品分別連續(xù)進樣8針。

數(shù)據(jù)分析方法:進樣后，將得到的4組數(shù)據(jù)(每組8針，共計32個數(shù)據(jù))導(dǎo)入分析軟件EZinfo2.0，進行多維數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 4組數(shù)據(jù)的比較

通過EZinfo2.0軟件的EDIT METHOD進行參數(shù)設(shè)置，對4組樣品(每組8針)揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)據(jù)進行PCA-X分析，得到圖1。從圖中可以看出，4組分析樣品揮發(fā)性成分之間有顯著性差異。初步分析，蓮霧葉提取物和柚子葉提取物之間由于植物的不同存在有較大差異，其中，蓮霧新葉提取物與蓮霧老葉提取物之間的差異較大，而新老柚子葉提取物之間差異較小，初步可以看出生理期對柚子葉揮發(fā)性成分的影響比蓮霧葉小。

圖1 4組分析樣品揮發(fā)性成分的PCA-X分析Fig.1 The PCA-X score plot of the four samples

表1 4組數(shù)據(jù)適合度分析的R2與Q2值Table 1 The R2and Q2value of goodness of the model fit

對4組數(shù)據(jù)-柚子新葉、柚子老葉、蓮霧新葉、蓮霧老葉進行主成分1、2的適合度分析，得到其R2與Q2值，見表1，可以看出，主成分1、2的對四組數(shù)據(jù)分組的累計貢獻率均大于0.8，其中主成分2對4組樣品的差異性的累計貢獻率較大。

將四組數(shù)據(jù)做載荷圖分析，載荷圖是用來每個變量分子對主成分的貢獻，如果Loading值比較大的話，其對主成分貢獻就會比較大。分別得到每個變量分子對主成分1、2貢獻值數(shù)據(jù)，其中貢獻值大于0.08的變量分子結(jié)果見表2、3?？梢钥闯鲋鞒煞?、2的貢獻率較大的變量分子的保留時間集中在12.28 ～ 23.04 min。

圖2 4組數(shù)據(jù)的載荷圖分析Fig.2 The loading plot of the developed model with the four samples'data set

表3 變量分子對主成分2的載荷值Table 3 The loading value of variable to principal component 2

2.2 柚子葉與蓮霧葉的比較

用EZinfo2.0軟件對柚子葉的兩組數(shù)據(jù)與蓮霧葉的兩組數(shù)據(jù)進行GROUP DIFFERENCES分析，點擊S-PLOT散點圖類型，得到圖3?？梢钥闯?，分組分析后柚子葉提取物與蓮霧葉提取物的離子碎片大多是處在不同的區(qū)塊，在大多數(shù)成分上是具有顯著性差異的。

圖3 柚子葉與蓮霧葉碎片離子的S-PLOT圖Fig.3 The S-plot of the extract ion fragment between waxapple leaves and pomelo leaves

2.3 新老蓮霧葉的比較

從圖1中提取蓮霧新老葉兩組數(shù)據(jù)進行GROUP DIFFERENCES分析，得到其相關(guān)系數(shù)圖(圖4)和S-PLOT圖(圖5)，從圖4中可以看出，圖中蓮霧老葉的變量分子相較于蓮霧新葉相對于Y軸的離散程度大，相關(guān)系數(shù)圖主要看各個變量相對Y軸的離散程度，離散的越遠(yuǎn)對分組的影響越大。說明蓮霧老葉所含變量對蓮霧新老葉的分組的影響較大。證明蓮霧葉片在不同生理期所表現(xiàn)出的香味風(fēng)格特點上有明顯區(qū)別，與人工嗅聞結(jié)果一致。結(jié)合NIST2008、WILEY譜圖庫及相關(guān)文獻，對S-PLOT圖中蓮霧新老葉片提取物的協(xié)方差系數(shù)大于0.1(協(xié)方差系數(shù)=p［1］/p(corr)［1］)的離子碎片進行分析，部分結(jié)果見表1和表2。

圖4 新老蓮霧葉的系數(shù)圖Fig.4 The coefficients of different period of wax-apple leaves

圖5 新老蓮霧葉的S-PLOT圖Fig.5 The S-plot of different period's wax apples leaves

表4 蓮霧老葉較蓮霧新葉多的部分化合物Table 4 Additional compounds only detected in wax-apple stale leaves

表5 蓮霧新葉較蓮霧老葉多的部分化合物Table 5 Additional compounds only detected in wax-apple fresh leaves

根據(jù)表4和表5的結(jié)果顯示，蓮霧新老葉片所表現(xiàn)出的香味特征上有較大區(qū)別，說明蓮霧葉片在生理過程中揮發(fā)性成分發(fā)生了較大的改變，蓮霧老葉較之蓮霧新葉多出的物質(zhì)有α-萜品烯、雙戊烯、1，2-二乙苯、1，2，3，4-四甲基苯等，相較于蓮霧新葉這些揮發(fā)性成分大多會增加加工產(chǎn)品的刺激性，而蓮霧新葉的揮發(fā)性成分較多且大多為應(yīng)用于工化工、食品的香料。因此，蓮霧葉的采收宜在前期進行。

2.4 新老柚子葉的比較

圖6 新老柚子葉的系數(shù)圖Fig.6 The coefficients of different period of pomelo leaves

用同樣處理方法對新老柚子葉提取物揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)據(jù)進行分組對比，同樣得到其相關(guān)系數(shù)圖(圖6)和S-PLOT圖(圖7)，從圖6中可以看出，柚子新老葉片的變量分子相對于Y軸的離散程度相差不大，說明柚子葉片所含的揮發(fā)性成分在其生理過程中沒有產(chǎn)生太大的變化，結(jié)果與圖1的分析結(jié)果一致。柚子老葉的變量分子相較于柚子新葉相對于Y軸的離散程度稍大，說明柚子老葉所含變量對柚子新老葉的分組的影響較大。證明柚子葉片在不同生理期的揮發(fā)性成分也是有所區(qū)別，與人工嗅聞結(jié)果一致。

圖7 新老柚子葉的S-PLOT圖Fig.7 The S-plot of different period's pomelo leave

表6 柚子老葉較柚子新葉多的一些化合物碎片Table 6 Additional fragments information of pomelo stale leaves compared to pomelo fresh leaves

表7 柚子新葉較柚子老葉多的一些化合物碎片Table 7 Additional fragments information of pomelo fresh leaves compared to pomelo stale leaves

從圖7可以看出，柚子老葉所含的揮發(fā)性分子較之柚子新葉多，結(jié)合NIST2008、WILEY譜圖庫及相關(guān)文獻，對S-PLOT圖中柚子新老葉提取物的協(xié)方差系數(shù)大于0.1的離子碎片進行檢索，部分結(jié)果見表6和表7。柚子新葉中的3-蒈烯的含量較老葉子多，另一方面，老葉子顯相對于新葉子著性增加的化合物較多，如石竹烯、松油烯、羅漢柏烯等，且這些物質(zhì)常用于加工或合成食用或日化用香精香料。以上分析結(jié)果表明，柚子葉的采收宜在后期，這樣有利于柚子葉中揮發(fā)性化合物的富集。

3 結(jié)論

本研究對不同生理期的蓮霧葉片和柚子葉片進行同時蒸餾萃取得到提取物，采用高分辨質(zhì)譜得到4組天然植物提取物的揮發(fā)性成分譜圖，通過多維數(shù)理統(tǒng)計對譜圖數(shù)據(jù)進行分析，對比研究4組之間碎片離子的差異，從碎片離子的數(shù)量和強度來表征樣品揮發(fā)性成分的差異，并分別對蓮霧新老葉提取物與柚子新老葉提取物揮發(fā)性成分中協(xié)方差系數(shù)大于0.1的部分離子碎片進行了定性分析，用數(shù)據(jù)證明了4組植物樣品嗅聞香氣風(fēng)格存在的差異與揮發(fā)性成分譜圖差異的一致性。根據(jù)分析結(jié)果可得出，蓮霧葉的采摘期宜在前期進行，因蓮霧新葉的揮發(fā)性成分較多且大多可應(yīng)用于工化工、食品;而柚子葉適宜采摘期則在后期，有利于柚子葉片中物質(zhì)的富集;實驗結(jié)果為不同生理期的柚子葉與蓮霧葉作為香原料開發(fā)與綜合利用提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 He TN(何廷農(nóng)).Flora Republicae Popularis Sinicae(中國植物志).Beijing:Science Press(科學(xué)出版社)，1988.

2 Peng QJ(彭清靜)，Peng QZ(彭清忠)，Yang DM(楊冬梅).The technology of extracting volatile oil from pomelo leaf with supercritical carbon dioxide.J JiShou Univ，Nat Sci Ed(吉首大學(xué)學(xué)報，自科版)，2004，25:76-78.

3 Li QY(李全英).The relationship about the quality of rice with blade carbohydrate content in different period.Agric Sci Technol Comm(農(nóng)業(yè)科技通訊)，2001，3:86-87.

4 Umetrics company.EZinfo Software documentation.Available from:http://www.scientific-computing.com/products/product_details.php?product_id=431.