吳少科 曾榮 郭偉韜 鐘環(huán) 譚宏昌 胡資兵 魏勁松 魏波 康毅

·論著·

VEGF-165-GMs復(fù)合自體顆粒骨修復(fù)兔陳舊性橈骨缺損的實驗研究

吳少科 曾榮 郭偉韜 鐘環(huán) 譚宏昌 胡資兵 魏勁松 魏波 康毅

目的 探討VEGF-165-GMs復(fù)合自體顆粒骨修復(fù)兔陳舊性橈骨缺損的效果。方法 24只新西蘭大白兔雙側(cè)橈骨均建立1.5 cm的陳舊性骨缺損實驗?zāi)Ｐ? 隨機分為A、B、C三組, A組植入自體顆粒骨+VEGF-165-GMs 1mg；B組植入200 mg自體顆粒骨；C組 VEGF-165-GMs 1 mg；分別于術(shù)后3、6、9周切取標(biāo)本,通過X線攝片、骨密度測量、生物力學(xué)測試、組織形態(tài)學(xué)觀察等手段,觀察各個時期新骨形成的情況。結(jié)果 A、B組均能較好地修復(fù)陳舊性骨缺損, A組術(shù)后各時間點X線評分、骨密度測量、生物力學(xué)測試、組織形態(tài)學(xué)觀察均明顯優(yōu)于B組。C組各時間點均無骨性愈合跡象, 9周時可見骨斷端完全硬化, 髓腔封閉。結(jié)論 VEGF-165-GMs復(fù)合自體顆粒骨修復(fù)陳舊性骨缺損可以明顯促進局部血運重建, 促進新生骨形成, 提高骨改建塑形的速度和質(zhì)量。

血管內(nèi)皮生長因子-165；自體顆粒骨 ；陳舊性橈骨缺損；骨修復(fù)

由于自體骨移植無免疫排斥反應(yīng), 組織相容性好, 生物學(xué)潛能大, 骨誘導(dǎo)和傳導(dǎo)作用強, 是骨缺損治療的“金標(biāo)準”。移植骨在植入人體后能否發(fā)揮最大作用, 很大程度取決于其與宿主的血運重新建立, 移植骨的血管化是骨修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié), 因此早期建立有效血供對提高自體骨移植的療效有著重要意義。血管內(nèi)皮生長因子-165(Vasular endothelial growth factor-165,VEGF-165)通過與血管內(nèi)皮細胞膜上受體結(jié)合,具有強大特異性促血管內(nèi)皮細胞增生和血管生成作用, 是促進血管再生的最后通道。本實驗探討應(yīng)用自體顆粒骨復(fù)合VEGF修復(fù)陳舊性骨缺損的能力, 為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。并考慮到VEGF在局部代謝快、作用不持久的問題, 決定將VEGF-165制成緩釋載體(Vasular endothelial growth factor-165-gelatinmierospheres, VEGF-165-GMs), 從而為進一步應(yīng)用于骨組織工程研究提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器 新西蘭大白兔24只(48條橈骨)(廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供), 體重2.5～2.8 kg；VEGF-165 (Pepro Tech北京博蕾德生物有限公司分裝) ；雙能X線密度儀( GE Lunar Prodigy 暨南大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科)；生物力學(xué)試驗機(MTS 858 Mini Bionix南方醫(yī)科大學(xué)生物力學(xué)實驗室)

1.2 VEGF-165-GMs制備 采用改良的雙相乳化冷凝交聯(lián)法制備明膠微球［1］, 并檢測明膠微球的物理性質(zhì), 以及結(jié)合和體外緩釋VEGF-165性能和規(guī)律(另文發(fā)表)。證實VEGF-165明膠緩釋微球有良好的藥物包封、緩釋功能,VEGF-165-GMs載藥率為0.2%。

1.3 VEGF-165-GM復(fù)合自體顆粒骨修復(fù)兔陳舊性橈骨缺損 參照文獻報道制作兔橈骨陳舊性骨缺損模型［2］并隨機分為三組：A組(9只18條前臂)：植入200 mg自體顆粒骨+VEGF-165-GMs 1mg；s B組(9只18條前臂):植入200 mg自體顆粒骨；C組(6只12條前臂):植入VEGF-165-GMs 1 mg。

手術(shù)方法：①在按前文所述建造的兔陳舊性骨缺損模型上, 于雙側(cè)橈骨原切口入將骨折端硬化部分連同纖維瘢痕組織一并切除, 將閉鎖的髓腔開放, 經(jīng)處理后的骨缺損段長1.5 cm ；②取一側(cè)自體髂骨塊在冰鹽水中用磨鉆磨成顆粒骨,離心收集；③A組植入200 mg自體顆粒骨, 1 mg VEGF-165-GMs充分混合, 形成復(fù)合物, 用內(nèi)徑0.6 cm、長1.5 cm管狀物塑形后植于骨缺損部位；B組植入200 mg自體顆粒骨混合物；C組植入植入塑形的1mg VEGF-165-GMs；④ 逐層縫合切口。分為術(shù)后3、6、9周三個時間點觀察,A、B組各時間點隨機處死3只兔, C組各時間點各處死隨機2只兔。

1.4 檢測項目及方法 (1)X線觀察 行動物雙側(cè)前肢X線正位片檢查, 評估各時間點的骨形成及骨塑性構(gòu)建情況。(2) 骨密度檢查: 取6、9周兔橈骨利用雙能X線骨密度儀小動物用骨密度測量軟件檢測包括骨缺損區(qū)在內(nèi)橈骨中段2．0cm骨密度。(3)生物力學(xué)檢查: 取6、9周標(biāo)本進行橈骨三點彎曲試驗。(4)病理組織學(xué): 在普通光學(xué)顯微鏡下觀察骨缺損修復(fù)及顆粒骨與周圍骨質(zhì)融合情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)檢驗實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計軟件分析, 計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差(x-±s)表示, P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。若方差齊性, 采用單因素方差分析方法(one-way ANOVA)進行檢驗, 用LSD法進行多重比較；若方差不齊, 用Welch近似方差分析法進行檢驗,用Dunnett’s T3法進行多重比較, P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 X線攝片檢查結(jié)果 A、B組3周時均可見植入物云霧樣改變, 與宿骨間有模糊骨痂形成, 但A組模糊影較大(見圖1.1)；6周時兩組的骨折線均消失, 骨缺損區(qū)骨形成充滿骨痂, A組髓腔部分再通, 皮質(zhì)骨改建塑性, B組髓腔仍為骨痂填充, 未改建塑性(見圖1.2)；9周時, A、B組均有較滿意的骨修復(fù)效果, 但B組塑形效果較差, 髓腔僅部分相通(見圖1.3)。C組各時間點均無骨性愈合跡象(見圖1.4)。

圖1.1 A組3周X光

B組3周X光

圖1.2 A組6周X光

B組6周X光

圖1.3 A組9周X光

B組9周X光

圖1.4 C組X光

2.2 骨密度檢測 術(shù)后6周及9周A組骨密度值均大于B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 各組9周骨密度均較6周時高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見表1)。

表1 各時間點骨密度檢測(g/cm2 , x-±s)

2.3 生物力學(xué)測定 三點彎曲實驗中各時間點A組橈骨最大載荷均比B組大, 差異有統(tǒng)計學(xué)意(P＜0.05)；隨修復(fù)時間延長,骨骼質(zhì)量增強, 組內(nèi)比較有差異, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見表 2)。

表2 三點彎曲實驗橈骨最大載荷檢測(N, x-±s)

三點彎曲橈骨位移橈度統(tǒng)計結(jié)果與最大載荷結(jié)果基本一致 (見表 3)。

表3 三點彎曲實驗橈骨位移橈度檢測(n=6, mm, x-±s)

2.4 組織學(xué)檢查 3周時A組顆粒骨融合并有大片新生骨形成, 移植顆粒骨間無成纖維細胞浸潤生長, 無死骨形成,顆粒骨與宿骨間融合生長, 新骨中有豐富的血管存在(圖2.1)。B組顆粒骨間有較多的成纖維細胞生長填充顆粒骨間,有散在深染的死骨形成(圖2.2)。6周A組顆粒骨融合成片狀,內(nèi)部形成松質(zhì)骨樣結(jié)構(gòu), 新骨中存在豐富的血管, 中板層樣結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)雛形(見圖2.3)；B組顆粒骨間皮質(zhì)骨尚未形成統(tǒng)一方向的骨板(見圖2.4)。9周時A組皮質(zhì)骨、髓腔改建塑性完成, 有正常皮質(zhì), 骨髓腔形成, 內(nèi)容正常的骨髓組織(圖2.5), B組髓腔亦形成, 但較為狹窄, 皮質(zhì)骨未完全改建, 仍可見較多小血管穿行其中, 未形成致密的骨質(zhì)(見2.6)。 C組組織學(xué)表現(xiàn)與陳舊性骨缺損表現(xiàn)相似, 6周時仍然見較多未分化間充質(zhì)細胞及小血管, 成熟纖維細胞較少(見圖 2.7)。

圖2.1 A組3周顆粒骨與宿主骨融合(HE×40)

圖2.2 B組3周散在死骨形成(HE×40)

圖2.3 A組6周靠近骨膜部分改建形成與縱軸平行的骨板，骨髓樣組織形成。(HE×40)

圖2.5 A組9周改建基本完成(HE×40)

圖2.6 B組9周皮質(zhì)骨正在改建塑形(HE×40)

圖2.7 未分化的間充質(zhì)細胞和小血管(HE×100)

3 討論

血管生成是骨修復(fù)的前提和基礎(chǔ), 沒有新生血管就沒有骨骼的修復(fù), 這已成為共識。VEGF又稱血管通透因子,VEGF與血管內(nèi)皮細胞膜上受體結(jié)合, 具有強大特異性促血管內(nèi)皮細胞增生和血管成形作用, 是促進血管再生的最后通道［3］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)VEGF缺乏所導(dǎo)致動物骨不連病理變化與臨床骨不連病理改變極其相似, 從而判斷VEGF缺乏是骨不連發(fā)生的原因之一［4］。VEGF在骨再生和骨修復(fù)的作用已得到了更多的證實［5］,其主要通過促進局部新生血管形成［6］及引發(fā)成骨細胞的遷移、分化、增殖［7］等作用來增強骨缺損修復(fù)能力, 是許多調(diào)節(jié)骨的生長和改建生長因子中非常重要的一種。

本次實驗中實驗組移植骨存活率高、無死骨形成, 早期大量的新生軟骨形成, 顆粒骨間融合, 移植物與宿主骨整合等骨修復(fù)表現(xiàn)比對照組更優(yōu),其原因可能是緩釋的VEGF-165促進新生血管形成, 改善局部血運, 使移植骨保留其細胞活性直接促進骨修復(fù), 同時帶入間充質(zhì)骨細胞向成骨細胞方向分化, 形成新骨, 優(yōu)于單純移植顆粒骨經(jīng)歷的“爬行替代”過程。VEGF-165還可以通過血管內(nèi)皮細胞來間接參與骨修復(fù)過程, Palazzini S等［8］發(fā)現(xiàn)新生的血管內(nèi)皮細胞可以促進骨髓干細胞向成骨源性細胞方向分化, 在外源性VEGF-165作用下實驗組新生血管形成早、多, 進而觀察到后續(xù)骨痂形成較為規(guī)整, 新骨形成量多, 板層骨形成較早, 骨改建塑形所需的時間短, 其修復(fù)效果更佳、更快, 在后期X線評分及組織學(xué)檢查結(jié)果均優(yōu)于對照組, 從側(cè)面證實了Palazzini S的觀點。

結(jié)果表明VEGF-165-GMs復(fù)合自體顆粒骨能增強顆粒骨血運重建, 提高移植骨的存活, 誘導(dǎo)新骨形成, 加快骨骼改建塑形, 從而促進骨修復(fù)。但具體的作用機制尚不明確,還需進一步的實驗研究探討, 所涉及的細胞信號途徑等一系列問題也有待后續(xù)的實驗研究加以明確。

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Experiment on repairing obsolete radial defects in rabbits with the composite of VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone

WU Shaoa-ke, ZENG Rong,GUO Wei-tao, et al.
Department of Orthopedics ,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhangjiang 524001,China

Objective To explore the effect about composite of VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone on the repairing obsolete radial defects in rabbits.Methods Make obsolete radial defect model on 24 rabbits’double radial,then randomly divided into A, B, C groups.A group treated with the compound of the VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone on obsolete radial defects, B group treated with autogenous morselized bone only, C group treated with VEGF-165-GMs ; animals were put to death at different time points(3,6,9 week) to get the model, through X-ray imaging, bone density measure,biomechanics test, histology compare to understand the growth condition of new bone at different time points.Results A,B groups both active repair obsolete radial defects in rabbits.But A group reflected better in X-ray imaging, bone density measure ,biomechanics test, histology compare.C group has no synostosis at any time.In 9 week the broken ends of fractured bone to become complete sclerosis, and the canals of de Candolle were blockaged.Conclusion The composite of VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone can distinguished enhance local revascularization, and promote neoplastic bone formation, improve the speed and quality of bone remodeling and bone moulding.

Vasular endothelial growth factor-165; Autogenous morselized bone ; Obsolete radial defects ;bone repair.

廣東省科技計劃項目(項目編號：2010B031600288)；湛江科技攻關(guān)計劃項目(項目編號：2012C3102030)

524023 湛江, 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科

E-mail：wushaoke@yahoo.cn