馬伯軍, 鄭茜茜, 張萍華, 胡娜娜, 陳析豐

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

水稻Xa7基因抗白葉枯病應答中的活性氧代謝分析*

馬伯軍, 鄭茜茜, 張萍華, 胡娜娜, 陳析豐

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

白葉枯病是由革蘭氏陰性黃單孢菌水稻變種(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae，Xoo)所引起的一種世界性水稻細菌病害.水稻Xa7基因是一個具有廣譜抗性的顯性抗白葉枯病基因.通過對水稻抗病品種IRBB7(含Xa7)和感病對照IR24接種白葉枯菌PXO86，發(fā)現(xiàn):在葉片的病原菌侵染部位，IRBB7比IR24的活性氧(H2O2和O2-)積累更快且含量更高;與活性氧代謝相關的酶,如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶和過氧化物酶的活性也更高.推測活性氧的代謝調(diào)節(jié)可能在Xa7基因介導的抗病反應中起作用.

水稻；抗白葉枯??；Xa7基因；活性氧

活性氧(reactive oxygen species，ROS)的迅速積累(又稱氧迸發(fā))是植物抗病應答的早期特征之一[1].活性氧在植物抗病機制中起著重要作用，除了能直接抑制病原菌的生長，還是激活抗病應答的一種信號分子[2].但是，生物或非生物逆境脅迫產(chǎn)生的活性氧往往對植物細胞有毒害作用，所以植物具有一套清除活性氧的酶系統(tǒng)[3]，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和過氧化氫酶(catalase，CAT)等.植物必須分清活性氧產(chǎn)生的信號來源，通過調(diào)節(jié)各種活性氧清除酶的活性，維持細胞內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡，在發(fā)揮活性氧生理功能的同時保護細胞不受毒害.

白葉枯病是水稻的一種嚴重細菌性病害.有關白葉枯病菌對水稻活性氧代謝影響的研究已有很多報道[4-9]，但結果卻不盡一致，表明水稻抗病中活性氧的調(diào)節(jié)機制可能比較復雜.水稻Xa7基因是一個高抗、廣譜、持久的抗白葉枯病基因[10-13].但是，至今Xa7基因仍未被克隆，其抗病機制也不清楚.本研究對含Xa7基因的水稻和感病對照品種接種白葉枯病菌，測定了不同時間段其活性氧含量及其清除酶活性，探討了活性氧在水稻Xa7基因抗病應答中的作用.

1 材料與方法

1.1水稻培養(yǎng)及白葉枯病接種

2011年5月中旬，在金華試驗田播種抗病秈稻IRBB7(OryzaSativaL. ssp.indica)及其感病近等基因系IR24.待成株期，用剪葉法[14]接種白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae)菲律賓小種PXO86，以清水接種作對照.接種后0，6，12，24和48 h取距離剪口3～5 cm長的葉片組織，貯存于-80 ℃?zhèn)溆?

接種體制備方法：將菌株接種在PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯300 g/L，葡萄糖30 g/L，瓊脂15 g/L)上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，用蒸餾水從培養(yǎng)基上洗下菌落，并稀釋成9×108cfu/mL的細菌懸浮液.

1.2H2O2的提取和含量測定

H2O2的提取和含量測定參照Patterson等[15]的方法，并稍作改進：取0.7 g葉片以冷丙酮研磨成勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液用冷丙酮定容至10 mL.取1 mL提取液加0.1 mL50 g/L硫酸鈦溶液和0.2 mL濃氨水，3 000 r/min離心10 min，棄上清，然后用冰丙酮反復洗滌3～5次，直至除去植物色素，再向沉淀中加5 mL2 mol/L硫酸溶液，待沉淀完全溶解后，于415 nm波長下比色.按同樣程序制備H2O2標準曲線，標準H2O2溶液用KMnO4法標定.

1.3O2-的提取和含量測定

O2-的提取和含量測定采用羥胺氧化法.取待測植物樣品0.7 g于研缽中，加5 mL 65 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.8)研磨成勻漿，10 000 r/min離心10 min，取上清液用上述磷酸緩沖溶液定容至10 mL.取提取液2 mL，加磷酸緩沖溶液1.5 mL和10 mmol/L鹽酸羥胺溶液0.5 mL，混合后25 ℃恒溫水浴保溫20 min.從上述試管中取反應液2 mL，加2 mL 17 mmol/L對氨基苯磺酸溶液和2 mL 7 mmol/Lα-萘胺溶液，30 ℃恒溫水浴中反應30 min，于530 nm波長下比色.按同樣程序制備O2-標準曲線.

1.4活性氧代謝相關酶的制備與活性測定

酶液制備參照Sato等[16]方法.取0.1 g葉片用50 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH 7.0)研磨，勻漿于4 ℃ 10 000 r/min離心20 min，上清液立即用于酶活性分析.

SOD活性測定參照文獻[17]的方法；POD活性測定參照文獻[18]的方法；CAT活性測定參照文獻[17]的方法；APX活性測定參照文獻[19]的方法.蛋白質(zhì)含量測定參照文獻[20]的考馬斯亮藍法進行.

以上測定所用植物樣品均取自至少4株不同的單株，每一處理測定3個樣品，3次生物性重復.

2 結果與分析

將IRBB7(含Xa7)和IR24(感病對照)在試驗田內(nèi)播種，長至成株期時接種白葉枯病菌PXO86，以清水接種作對照.接種后15 d測定病斑長度，IRBB7的病斑長度均小于2 cm，而IR24的病斑長度均大于15 cm，表現(xiàn)出明顯的抗感差異，表明Xa7基因啟動了抗病應答反應.為了研究Xa7介導的抗性與活性氧代謝間的關系，本實驗對接種后0，6，12，24和48 h的葉片進行了分析，測定了活性氧H2O2和O2-的含量及其相關代謝酶，如SOD，CAT，APX和POD的活性變化.

2.1O2-含量變化

IRBB7和IR24葉片接種白葉枯病菌PXO86后，葉片內(nèi)O2-含量上升，于6 h達到最大值，而后有所下降(見圖1(a)).相對于IR24接菌葉片，IRBB7接菌葉片內(nèi)O2-積累快且含量高.IRBB7接菌后葉片中O2-含量最大值(6 h時)比IR24接菌葉片的最大值(6 h時)高出25.5%.與接水相比，IRBB7接菌葉片中O2-含量最大值(6 h時)比同期接水葉片的最大值(6 h時)高23.5%；而IR24接菌葉片中O2-含量最大值(6 h時)比同期接水葉片的最大值(6 h時)只高出4.7%.

2.2H2O2含量變化

IRBB7和IR24葉片接種白葉枯病菌PXO86后，葉片內(nèi)H2O2含量上升，于12 h達到最大值，而后有所下降(見圖1(b)).相對于IR24接菌葉片，IRBB7葉片內(nèi)H2O2積累快且含量高.在6 h這一時間點上，IRBB7接菌后葉片中H2O2含量比IR24接菌后葉片中H2O2含量高40.9%.IRBB7接菌葉片中H2O2含量比同期接水葉片中H2O2含量高出59.6%；而IR24接菌葉片中H2O2含量比同期接水葉片中H2O2含量只高1.1%.

R-P2：IRBB7接種PXO86；R-H2O：IRBB7接種清水；S-P2：IR24接種PXO86；S-H2O：IR24接種清水圖1 接種白葉枯病菌后水稻葉片中活性氧含量的變化

2.3SOD活性變化

IRBB7和IR24葉片接種白葉枯病菌PXO86后，葉片中SOD活性先呈上升趨勢，24 h達到最大值，而后下降(見圖2(a)).IRBB7接菌后葉片中SOD活性始終高于IR24接菌后，最高值(24 h時)比IR24接菌后的最高值(24 h時)高出25.6%.與接水相比，IRBB7接菌葉片中SOD活性最大值(24 h時)比同期接水葉片的最高值(24 h時)高44.1%；而IR24接菌葉片中SOD活性最高值(24 h時)比同期接水葉片的最高值(24 h時)只高4.6%.

2.4APX活性變化

IRBB7和IR24葉片接種白葉枯病菌PXO86后，葉片中APX活性在12 h后呈下降趨勢，24 h達到最小值，而后上升，48 h達到最大值(見圖2(b)).IRBB7接菌葉片中APX活性最高值(48 h時)比IR24接菌葉片的最高值(48 h時)高出43.6%.與接水相比，IRBB7接菌葉片中APX活性最大值(48 h時)比同期接水葉片的最高值(12 h時)高出54.3%，而IR24接菌葉片內(nèi)APX活性最高值(48 h時)比同期接水葉片的最高值(48 h時)只高出14.9%.

2.5CAT活性變化

IRBB7和IR24葉片接種白葉枯病菌PXO86后，IRBB7葉片中CAT活性起初有所上升，而后在6～12 h有所回落，在12～24 h又有所回升,并在24 h達到最大值，之后在24～48 h又有所下降;IR24葉片中CAT活性起初有所下降，而后在6～12 h有所回升，于12 h達到最大值，在12～48 h又有所下降(見圖2(c)).IRBB7接菌葉片內(nèi)CAT活性始終高于IR24葉片的CAT活性，其最高值(24 h時)高于IR24接菌葉片最高值(12 h時)64.0%.與清水接種相比，IRBB7接菌葉片中CAT活性最高值(24 h時)高于同期清水接種葉片最高值(6 h時)10.0%，IR24接菌葉片內(nèi)CAT活性最高值(12 h時)低于同期接種清水葉片最高值(6 h時)33.2%.就6 h這一時間點而言，IRBB7接菌葉片CAT活性高于IR24接菌葉片CAT活性96.9%;與接水相比，IRBB7接菌葉片中CAT活性比同期接水葉片只高出6.3%，IR24接菌葉片內(nèi)CAT活性低于同期接水葉片的65.5%.

R-P2：IRBB7接種PXO86；R-H2O：IRBB7接種清水；S-P2：IR24接種PXO86；S-H2O：IR24接種清水圖2 接種白葉枯病菌后水稻葉片中活性氧代謝相關酶活性的變化

2.6POD活性變化

IRBB7和IR24葉片接種白葉枯病菌PXO86后，IRBB7葉片中POD活性呈上升趨勢，48 h達到最大值;IR24葉片中POD活性在0～6 h有所下降，而后呈上升趨勢，48 h達到最大值(見圖2(d)).IRBB7接菌后葉片內(nèi)POD活性始終高于IR24接菌葉片中POD活性，其最高值(48 h時)高于IR24接菌葉片最高值(24 h時)61.6%.與接水相比，IRBB7接菌葉片中POD活性最高值(48 h時)高于同期接水葉片最高值(12 h時)35.0%，而IR24接菌葉片內(nèi)POD活性最高值(24 h時)比同期接水葉片最高值(24 h時)低1.3%.

3 討 論

植物細胞中H2O2和O2-是2種主要的活性氧.在生物體內(nèi)活性氧廣泛存在并具有多種生理功能[21]，可直接抵御微生物、參與細胞壁木質(zhì)化及富含羥脯酸的糖蛋白的交聯(lián).此外，活性氧還可作為信號分子調(diào)控抗病相關基因的表達，激活超敏反應(hypersensitive response，HR)[22].本研究發(fā)現(xiàn)，接種白葉枯病菌PXO86后,IRBB7葉片中H2O2和O2-含量顯著高于IR24葉片.這一結果與文獻[4-9]的研究結果一致.推測Xa7介導的抗病性可能與植株體內(nèi)活性氧的快速積累有關.

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化氫酶(CAT)是植物細胞中主要的活性氧清除酶.SOD催化O2-生成H2O2，而 CAT，APX和 POD 則催化H2O2還原成H2O.在病原菌侵染后引起的不親和反應中，SOD，APX和POD的活性一般表現(xiàn)為上升，且高于親和反應；CAT活性則表現(xiàn)為下降，且低于親和反應[23-25].本研究結果顯示，水稻感染白葉枯病菌后，IRBB7葉片中SOD，CAT，APX和POD的活性均高于感病品種IR24葉片中這些酶的活性.這些活性氧清除酶的活性大幅度提高，可能有助于降低生物脅迫產(chǎn)生的活性氧毒害，提高水稻對白葉枯病菌的抗性.

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(責任編輯 薛 榮)

MetabolismofreactiveoxygenspeciesinresistantresponseofriceXa7genetobacterialblight

MA Bojun, ZHENG Xixi, Zhang Pinghua, HU Na′na, CHEN Xifeng

(CollegeofChemistryandLifeScience,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China)

Bacterial blight (BB), caused byXanthomonasoryzaepv.Oryzae, is one of the most serious worldwide disease of rice.Xa7 is a broadly dominant resistance gene directed against BB. The resistant rice cultivar IRBB7 (withXa7) and susceptible control IR24 were inoculated with strain PXO86 of BB. Comparison to the IR24, the leaves of IRBB7 accumulated reactive oxygen species (ROS; H2O2and O2-) faster and higher, the activity of active oxygen metabolism-related enzymes (SOD, CAT, APX and POD) of IRBB7 was higher in the infect site. It was suggested that the regulation of ROS metabolism might be helpful for theXa7-mediated disease resistance response.

rice; resistance of bacterial blight;Xa7 gene; reactive oxygen species

Q943;S432.1

A

1001-5051(2013)01-0001-05

2012-9-17

國家重大科技專項(2011ZX08009-003-001)；國家自然科學基金資助項目(31171519；31101130)；浙江省自然科學基金資助項目(Y3110234；Y3100531)；浙江省重點科技創(chuàng)新團隊項目(2010R50024)；浙江省公益性技術應用研究計劃項目(2011C22005)

馬伯軍(1965-),男，浙江嵊州人，教授,博士.研究方向：植物遺傳學.