李 軍， 王國榮， 張秀芹， 王 燕， 牟艷玲， 姚慶強△

(山東省醫(yī)學科學院 1藥物研究所, 2山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南 250062)

二苯乙烯苷對同型半胱氨酸誘導血管內皮細胞凋亡及bcl-2、bax、caspase-3表達的影響*

李 軍1,2， 王國榮1， 張秀芹1， 王 燕1， 牟艷玲1,2， 姚慶強1,2△

(山東省醫(yī)學科學院1藥物研究所,2山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南 250062)

目的研究何首烏二苯乙烯苷(TSG)對同型半胱氨酸(Hcy)誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)凋亡及bcl-2、bax和caspase-3 mRNA表達的影響。方法建立Hcy (3 mmol/L)所致培養(yǎng)HUVECs核損傷模型，TSG(1和10 μmol/L)提前2 h預孵育，然后再以Hcy處理，作為TSG保護組。用Hoechst 33342核染色法觀察HUVECs細胞核損傷狀態(tài)，以流式細胞術檢測細胞凋亡情況，用實時熒光定量RT-PCR法檢bcl-2、bax和caspase-3 mRNA的表達。結果經3 mmol/L Hcy處理后，與正常培養(yǎng)的細胞相比，HUVECs核損傷加重，凋亡細胞比例升高，bcl-2表達降低(P<0.01)，bax和caspase-3表達增加(P<0.01)。TSG 1 μmol/L和10 μmol/L預孵育后再經3 mmol/L Hcy處理，與單經3 mmol/L Hcy損傷模型組相比，HUVECs細胞核損傷降低，凋亡率下降，bcl-2的表達增加(P<0.05)，bax和caspase-3表達降低(P<0.05)。結論TSG具有降低Hcy所致HUVECs的細胞損傷和抑制凋亡的作用，其機制可能與影響bcl-2、bax和caspase-3的表達有關。

二苯乙烯苷； 同型半胱氨酸； 細胞凋亡； Bcl-2； Bax； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

血漿同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)水平升高是冠心病、腦血管疾病以及外周阻塞性血管疾病等心腦血管疾病的一個重要獨立危險因素[1-2]。體外細胞培養(yǎng)顯示Hcy 能誘導內皮細胞凋亡[3-4]；Hcy可損傷血管內皮促進動脈粥樣斑塊形成[5]。

何首烏(Polygonummultiflorum)2,3,5,4’-四羥基反式二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2,3,5,4’- tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside, TSG)可有效抑制高血脂癥模型大鼠的血脂升高，降低主動脈、冠狀動脈和頸總動脈脂質條紋面積，減少肝臟中的脂質沉積。TSG還能促進血管內皮細胞釋放一氧化氮(nitric oxide, NO)并具有很強的抗氧化特性[6]，抑制單核細胞分泌黏附分子和抑制內皮細胞與單核細胞的黏附[7]。目前關于TSG抗凋亡分子研究報道較少。特別是其對Hcy所致血管內皮細胞的凋亡干預作用不明。

本實驗通過對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的培養(yǎng)，研究應用TSG干預對Hcy誘導HUVECs凋亡及凋亡相關基因表達的影響，初步探討TSG抑制Hcy誘導HUVECs凋亡的可能分子作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

HUVECs由山東省醫(yī)學科學院藥物所藥理室提供。Hcy購自Sigma，DMEM培養(yǎng)基系Gibco產品，TSG為山東省醫(yī)學科學院藥物研究所分離，純度99%，胰蛋白酶和EDTA 混合液由Gibco生產，胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生產，Hoechst 33342細胞核凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所，RNA提取試劑由Promega生產，逆轉錄及SYBR GreenⅠReal Time PCR試劑由大連寶生物公司生產，引物由上海博彩生物公司合成。

2方法

HUVECs的培養(yǎng)和傳代方法同文獻[8]，實驗使用復蘇培養(yǎng)3～5代的細胞。

2.1細胞核形態(tài)學染色觀察 將HUVECs 按2×104cells/well的密度接種于24孔板內，以含10% FBS DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞長至50%時，改換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細胞同步化于G0期(細胞同步化)后，進行以下實驗。

實驗分為以下5組：正常培養(yǎng)基組、Hcy 3.0 mmol/L組、TSG(1 μmol/L、10 μmol/L)預孵育2 h再各加Hcy 3.0 mmol/L處理組。Hcy培養(yǎng)36 h后進行Hoechst 33342核染色檢測。實驗重復4次。

2.2Annexin V-FITC/PI雙染 取對數生長期細胞，調整濃度為1×109/L，種于25 mL培養(yǎng)瓶中。待細胞長至相互接觸，改換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細胞同步化于G0期(細胞同步化)后，按上一步的分組方法進行處理。加入Hcy作用36 h后，以0.25%胰蛋白酶消化細胞，1 200 r/min離心3 min，棄上清，PBS清洗，離心收集細胞，按照試劑盒說明，立即以Annexin V-FITC/PI雙染，用流式細胞儀檢測(激發(fā)波長為488 nm；發(fā)射波長為530 nm和575nm)細胞凋亡。CellQuest軟件進行數據分析。

2.3實時熒光定量RT-PCR檢測相關基因的表達 將HUVECs按1×105cells/well的密度接種于25 mL培養(yǎng)瓶，以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞長至相互接觸，改換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細胞同步化于G0期(細胞同步化)后，分為下列實驗組：正常對照組、Hcy(3 mmol/L)模型組、TSG1組和TSG10組(1和10 μmol/L TSG預孵育2 h再各加Hcy 3 mmol/L繼續(xù)培養(yǎng)12 h)。各處理組重復6次。

實驗結束后傾去上清液，以PBS快速洗滌3次，參照TRIzol試劑說明裂解細胞備以提取總RNA。

引物序列如表1。實時熒光定量PCR 25 μL反應體系由以下成份組成：12.5 μL 2 × Power SYBR? Green PCR Master Mix，1.0 μmol/L 的上、下游引物(序列見表1)，1 μL的逆轉錄產物，水。反應程序為：95 ℃ 10 min；循環(huán)反應為95 ℃ 8 s，60 ℃ 40 s，40個循環(huán)，在各循環(huán)的60 ℃ 40 s步驟進行熒光檢測；最后為熔解曲線步驟。每個樣品目的基因的表達閾值與內參照基因(mitochondrial ATP synthase 6，mATPsy6)表達閾值的差ΔCt為其相對表達量。各處理組目的基因的ΔCt與正常對照組目的基因的ΔCt差值計為ΔΔCt，以2-ΔΔCt表示為目的基因在藥物處理組的表達量與在正常組表達量的比值。

3統(tǒng)計學處理

用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnett’s T3檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1TSG對Hcy所致HUVECs細胞核形態(tài)學改變的影響

以Hoechst 33342染色，熒光顯微鏡下觀察TSG 對Hcy所致HUVECs細胞核形態(tài)學改變的影響。結果顯示與對照組相比，Hcy模型組以3 mmol/L Hcy孵育HUVECs 36 h，細胞核具凋亡形態(tài)特點，即胞核染色質凝集、邊聚化、胞核呈亮藍色熒光的細胞比例增多，見圖1。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列

分別以TSG 1 μmol/L和10 μmol/L預孵育HUVECs 2 h后，再以3 mmol/L Hcy孵育36 h，與Hcy處理相比，TSG處理可明顯減輕Hcy誘發(fā)的內皮細胞核形態(tài)損傷，表現為細胞核中染色體凝集、邊聚化的細胞比例減少，細胞核形態(tài)正常的細胞增多。顯示了TSG抑制Hcy對HUVECs細胞核損傷的作用，TSG 10 μmol/L降低Hcy所致HUVECs的損傷作用更好，見圖1。

Figure 1. Effect of TSG on HUVEC nuclear morphology damaged by Hcy. A：control; B：Hcy 3 mmol/L; C：TSG 1 μmol/L + Hcy 3 mmol/L; D：TSG 10 μmol/L + Hcy 3 mmol/L.

圖1TSG對Hcy所致HUVECs細胞核形態(tài)學損傷的影響

2TSG對Hcy所致HUVECs細胞凋亡的影響

Annexin V與PI染色后，通過流式細胞儀檢測TSG對Hcy所致HUVECs細胞凋亡的影響，結果顯示，Hcy孵育36 h，細胞凋亡率為23.63%，而以TSG 1 μmol/L和10 μmol/L預孵育HUVECs 2 h后再以Hcy處理36 h，細胞凋亡率分別降為7.02%和2.95%，見圖2。這說明TSG能抑制Hcy所致的HUVECs凋亡。

Figure 2. Effect of TSG on HUVEC apoptosis induced by Hcy.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsHcy group.

圖2TSG對Hcy所致HUVECs凋亡的影響

3TSG對Hcy所致HUVECs細胞凋亡相關分子表達的影響

3.1何首烏TSG對同型半胱氨酸致內皮細胞bcl-2 mRNA表達的影響 實時熒光定量RT-PCR結果檢測顯示， HUVECs模型組以3 mmol/L Hcy孵育12 h后，與對照組相比，其bcl-2 mRNA表達顯著降低(P<0.01)。

HUVECs以何首烏TSG 1 μmol/L和10 μmol/L孵育2 h再給予3 mmol/L Hcy孵育12 h處理，與Hcy模型組相比，bcl-2 mRNA的表達顯著增加。TSG的2個處理濃度與模型組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Effect of TSG on bcl-2 mRNA expression in HUVECs induced by Hcy.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHcy group.

圖3TSG對Hcy所致HUVECsbcl-2mRNA表達的影響

3.2何首烏TSG對Hcy致血管內皮細胞bax mRNA表達的影響 Hcy模型組HUVECs bax mRNA表達較正常對照組顯著升高(P<0.05)。

以10 μmol/L何首烏TSG孵育2 h再給予3 mmol/L Hcy孵育12 h處理HUVECs，與Hcy模型組相比，HUVECs bax mRNA表達降低(P<0.05)，見圖4。

3.3何首烏TSG對Hcy致血管內皮細胞caspase-3 mRNA表達的影響 Hcy模型組HUVECs的caspase-3 mRNA表達較正常對照組顯著升高(P<0.01)。

HUVECs以1 μmol/L和10 μmol/L何首烏TSG孵育2 h再給予3.0 mmol/L Hcy孵育12 h處理，與Hcy模型組相比，caspase-3 mRNA表達降低(P<0.05)，見圖5。

討 論

Hcy作為動脈粥樣硬化獨立危險因素之一近年來越來越受到重視，它可以通過損傷內皮細胞引起細胞凋亡、促進炎癥介質釋放等多方面引起動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[9]。Hcy主要是通過激活細胞凋亡的細胞膜途徑和線粒體途徑進而促進了內皮細胞的凋亡。Hcy可抑制內皮細胞bcl-2[10-11]的表達，促進內皮細胞Bax[10-11]和Fas[12]的表達，進而激活caspase-3[9-10]、caspase-6和p38的表達，產生促凋亡作用。本實驗結果證實Hcy誘導HUVECs凋亡時，HUVECs bax和casepase-3 mRNA表達較正常對照組顯著升高；而bcl-2 mRNA的表達呈下降的趨勢。

Figure 4. Effect of TSG on bax mRNA expression in HUVECs induced by Hcy.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsHcy group.

圖4TSG對Hcy所致HUVECsbaxmRNA表達的影響

Figure 5. Effect of TSG on caspase-3 mRNA expression in HUVECs induced by Hcy.Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsHcy group.

圖5TSG對Hcy所致HUVECscaspase-3mRNA表達的影響

何首烏作為傳統(tǒng)中藥，其TSG具有降血脂、防治動脈粥樣硬化、抗衰老、提高免疫功能作用[13-14]。TSG還能促進血管內皮細胞釋放NO并具有很強的抗氧化特性[6]，抑制單核細胞分泌黏附分子和抑制內皮細胞與單核細胞的黏附[7]。

本研究發(fā)現TSG預孵育可降低Hcy所致HUVECs細胞核損傷，降低凋亡細胞的比例。這一作用可能與何首烏TSG可提高Hcy損傷狀態(tài)下HUVECs的凋亡抑制基因bcl-2的表達有關，同時還可能與TSG降低Hcy損傷狀態(tài)下所致培養(yǎng)的HUVECs的促凋亡基因bax和caspase-3 mRNA的表達有關。推測TSG這一作用的原因可能與高濃度Hcy損傷內皮細胞主要是通過增加氧化損傷、而TSG具有抗氧化特性有關，但目前缺乏相關研究的直接證據，還需進一步研究證實。

本研究結果為臨床應用TSG提供了一定的基礎研究依據，為何首烏心血管活性的作用機制提供了一個新的補充，但TSG的抑制血管內皮細胞凋亡的活性有待從不同的角度進一步證實，且其抑制凋亡的機理亦需從多個途徑展開。

[1] Kazemi MB, Eshraghian K, Omrani GR, et al. Homocysteine level and coronary artery disease[J]. Angiology, 2006, 57(1):9-14.

[2] Ciaccio M, Bellia C. Hyperhomocysteinemia and cardiovascular risk: effect of vitamin supplementation in risk reduction[J]. Curr Clin Pharmacol, 2010, 5(1):30-36.

[3] 何志勇, 張 雄, 王小同. 葉酸拮抗同型半胱氨酸誘導的內皮細胞凋亡的作用機制[J]. 中國病理生理雜志，2007，23(4):699-701.

[4] 陳燕銘, 吳 琳, 劉 勇, 等. 通心絡對同型半胱氨酸損傷內皮細胞的基因表達譜的影響[J]. 中國病理生理雜志,2011,27(1):42- 47.

[5] Seo H, Oh H, Park H, et al. Contribution of dietary intakes of antioxidants to homocysteine-induced low density lipoprotein(LDL) oxidation in atherosclerotic patients[J]. Yonsei Med J, 2010, 51(4):526-533.

[6] Ye S, Tang L, Xu J, et al. Postconditioning’s protection of THSG on cardiac ischemia-reperfusion injury and mechanism[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2006, 26(1):13-16.

[7] Yang PY, Almofti MR, Lu L, et al. Reduction of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits and decrease of expressions of intracellular adhesion molecule-1 and vascular endothelial growth factor in foam cells by a water-soluble fraction ofPolygonummultiflorum[J]. J Pharmacol Sci, 2005, 99(3):294-300.

[8] 何志勇, 葉小軍, 邵勝敏. 同型半胱氨酸對內皮細胞凋亡及JNK表達的影響[J]. 心腦血管病防治, 2009, 9(2):100-102.

[9] Zeng XK, Remick DG, Wang X. Homocysteine induces production of monocyte chemoattractant protein-1 and interleukin-8 in cultured human whole blood[J]. Acta Pharmacol Sin, 2004, 25(11):1419-1425.

[10] Tyagi N, Ovechkin AV, Lominadze D, et al. Mitochondrial mechanism of microvascular endothelial cells apoptosis in hyperhomocysteinemia[J]. J Cell Biochem, 2006, 98(5):1150-1162.

[11] Dong F, Zhang X, Wold LE, et al. Endothelin-1 enhances oxidative stress, cell proliferation and reduces apoptosis in human umbilical vein endothelial cells: role of ETB receptor, NADPH oxidase and caveolin-1[J]. Br J Pharmacol, 2005, 145(3):323-333.

[12] Suhara T, Fukuo K, Yasuda O, et al. Homocysteine enhances endothelial apoptosis via upregulation of Fas-mediated pathways[J]. Hypertension,2004,43(6):1208-1213.

[13] 衛(wèi)培峰，焦晨莉，陳丹丹.何首烏現代藥理研究進展[J].現代中醫(yī)藥, 2004, 15(1):57-58.

[14] 陳萬生. 何首烏活性成分及品質評價[D].上海：第二軍醫(yī)大學, 2000.

Effectsoftetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucosideonapoptosisandexpressionofbcl-2/bax/caspase-3inHUVECstreatedwithhomocysteine

LI Jun1, 2, WANG Guo-rong1, ZHANG Xiu-qin1, WANG Yan1, MU Yan-ling1, 2, YAO Qing-qiang1, 2

(1InstituteofMateriaMedica,2ShandongProvincalKeyLaboratoryofRareandUncommonDiseases,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China.E-mail:yao_imm@163.com)

AIM: To explore the effects of tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside (TSG) fromPolygonummultiflorumon the apoptosis and the mRNA expression of bcl-2, bax and caspase-3 in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) treated with homocysteine (Hcy).METHODSCultured HUVECs were treated with Hcy (3 mmol/L) to establish a Hcy-damaged model. HUVECs in TSG treated groups were pre-incubated with TSG at concentrations of 1 μmol/L and 10 μmol/L for 2 h before treated with Hcy. Cell nuclear damage was detected by Hoechst 33342 staining. Cell apoptosis was determined by flow cytometry. The mRNA expression of bcl-2, bax and caspase-3 was measured by real-time fluorescence quantitative RT-PCR.RESULTSAfter treatment with Hcy at concentration of 3 mmol/L, the nuclear damage and apoptotic rate of HUVECs were higher than that in normal group. The expression of bcl-2 was lower, and the expression of Bax and caspase-3 was higher than that in normal group. On the other hand, pre-incubation with TSG at concentrations of 1 μmol/L and 10 μmol/L decreased the nuclear damage and cell apoptosis, increased the expression of bcl-2, and decreased the expression of bax and caspase-3 as compared with the cells only treated with Hcy.CONCLUSIONTSG reduces the apoptosis of HUVECs induced by Hcy, and the mechanism might be associated with regulating the expression of bcl-2, bax and caspase-3.

Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside; Homocysteine; Apoptosis; Bcl-2; Bax; Caspase-3

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.030

1000- 4718(2013)04- 0743- 05

2012- 07- 09

2013- 02- 28

山東省自然科學基金資助項目(No. ZR2008C317)

△通訊作者 Tel: 0531-82919960; E-mail: yao_imm@163.com