張曉歌， 陶小玲， 張賢銳， 蘇 立

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科，重慶400010)

血管緊張素Ⅱ(angiotensin II，AngⅡ)與其I 型受體(angiotensin II receptor 1，AT1)結(jié)合可通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)刺激炎癥，促進(jìn)細(xì)胞增殖及纖維化，導(dǎo)致心臟重構(gòu)。研究提示，胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PLGF)與心血管疾病的病理過(guò)程有密切聯(lián)系。在人血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，Ang II 可誘導(dǎo)PLGF 的表達(dá)［1］，在缺血性心肌病患者中PLGF 隨心力衰竭的加重而升高［2］。心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)在受到病理刺激后會(huì)發(fā)生增殖，其表型轉(zhuǎn)化為有分泌胞外基質(zhì)功能的肌成纖維細(xì)胞，在心臟重構(gòu)過(guò)程中具有重要作用［3］。心肌重構(gòu)過(guò)程中，在血液動(dòng)力學(xué)和神經(jīng)體液激素的影響下，各種炎癥細(xì)胞被激活，分泌大量炎癥因子，加劇纖維化的發(fā)展。研究表明，可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(soluble vascular endothelial growth factor receptor-1，sFlt-1)能夠通過(guò)特異性的捕獲PLGF 而抑制其活性，減少腹膜炎癥過(guò)程中膠原的沉積，對(duì)腹膜纖維化有一定的抑制作用［4］。在心肌成纖維細(xì)胞中，阻斷PLGF 對(duì)Ang II 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及纖維化是否具有抑制作用尚不清楚。本研究旨在探討PLGF 在Ang II 激活心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)及其作用。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物及主要試劑

出生2 ～3 d SD 大鼠，SPF 級(jí)，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。小鼠抗大鼠波形蛋白單克隆抗體和蛋白酶抑制劑試劑盒均購(gòu)自Abcam;Ang II、胰蛋白酶和II 型膠原酶均購(gòu)自Sigma-Aldrich;胎牛血清購(gòu)自Gibco;重組人PLGF 購(gòu)自Peprotech;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)和山羊單克隆抗體PLGF(anti-PLGF)購(gòu)自Santa Cruz;兔抗大鼠ERK1/2 和p-ERK1/2 購(gòu)自CST;DMEM/高糖培養(yǎng)基、兔抗山羊Ⅱ抗、山羊抗兔Ⅱ抗及山羊抗小鼠Ⅱ抗均購(gòu)自北京鼎國(guó)公司;RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒及小鼠抗大鼠α-tubulin 均購(gòu)自碧云天公司;Trizol Reagent、逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR 試劑盒及引物均購(gòu)自大連寶生生物公司。

2 主要方法

2.1 心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌開(kāi)胸剪取SD 大鼠心尖部(心室肌)組織，移入離心管后各加入3 mL濃度為0.08%胰蛋白酶和0.08%II 型膠原酶，37 ℃水浴中消化組織碎塊，重復(fù)3 ～4 次。收集各次消化所得細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，差速貼壁60 min 后棄去培養(yǎng)液，剩余貼壁細(xì)胞即為心臟成纖維細(xì)胞。將傳代2 次的心臟成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 WST-1 檢測(cè)細(xì)胞增殖 消化后用培養(yǎng)基吹散的細(xì)胞以4 000 cells/well 接種在96 孔板中，培養(yǎng)12 h 后無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h，藥物干預(yù)24 h 后，每孔加入WST-1 10 μL，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，振蕩混勻15 min 后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上470 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，用600 nm 的波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)。

2.3 免疫印跡 常規(guī)提取心肌組織總蛋白，BCA 法測(cè)定各組蛋白濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳，蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，封閉后分別稀釋Ⅰ抗［ERK1/2(1∶1 000)、p-ERK1/2(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶200)、PLGF(1∶200)和α-tubulin(1∶1 000)］孵育，4 ℃過(guò)夜，根據(jù)Ⅰ抗來(lái)源選用相應(yīng)HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗孵育，ECL 顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以特異性目的蛋白條帶光密度值與對(duì)應(yīng)α-tubulin 蛋白條帶吸光度值間的比值對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。

2.4 免疫熒光檢測(cè)α-SMA 的表達(dá) 將細(xì)胞種在24孔板的載玻片上，培養(yǎng)12 h，饑餓24 h，給予100 ng/L PLGF 干預(yù)24 h，4%多聚甲醛固定15 min，加1%BSA 室溫下封閉非特異抗原1 h，沖洗后加入α-SMA Ⅰ抗4 ℃過(guò)夜，加入抗大鼠熒光標(biāo)記Ⅱ抗37 ℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察分析。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收集細(xì)胞，用Trizol 提取總RNA，紫外分光法確定RNA 的濃度和純度，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性90 s 后進(jìn)入PCR 循環(huán):95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán);擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，從65 ℃緩慢加熱到95 ℃，以建立PCR 產(chǎn)物的熔解曲線。每個(gè)標(biāo)本均設(shè)置復(fù)管PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系:10 μL。引物序列如下:I 型膠原蛋白上游引物5'-TCTGACTGGAAGAGCGGAGAG-3'，下游引物5'-GAGTGGGGAACACACAGGTCT-3';III 型膠原蛋白上游引物5'-ACAGATGCTGGTGCTGAGAAGA-3'，下 游 引 物 5'-GCTGGAAAGAAGTCTGAGGAAGG-3';PLGF 上游引物5'-CTGCTGGGAACAACTCAACAGA -3'，下游引物5'-CTACAGCGACTCAGAAGGACACA-3';內(nèi)參 照 βactin 上游引物5'-ACGGTCACAGG TCATCACTATCG-3'，下游引物5'-GGCATAGAGGTCT TTACGGATG-3'。

數(shù)據(jù)的分析采用下述表達(dá)公式:目的mRNA 表達(dá)水平=2-ΔΔCt。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，多組均數(shù)比較采用單因素ANOVA 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD 法)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 17.0。

結(jié) 果

1 Ang II 對(duì)PLGF 表達(dá)的影響

據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Ang II(10-6mol/L)干預(yù)SD 大鼠的心臟成纖維細(xì)胞24 h，PLGF mRNA 表達(dá)水平最高，Ang II 可以增加PLGF 表達(dá)4.90 倍(P ＜0.01)。AT1受體阻斷劑telmisartan(10-6mol/L)和AngII(10-6mol/L)聯(lián)用干預(yù)后，PLGF mRNA 表達(dá)被抑制(P ＜0.05)，見(jiàn)圖1。圖2 示Ang II 可以誘導(dǎo)PLGF蛋白水平的表達(dá)上調(diào)(P ＜0.05)。上述結(jié)果表明，Ang II 可能通過(guò)AT1受體調(diào)節(jié)PLGF 在心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

Figure 1. Effect of Ang II on the mRNA expression of PLGF.Mean ±SD.n =5. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs Ang II.圖1 Ang II 對(duì)PLGF mRNA 表達(dá)的影響

Figure 2. Effect of Ang II on the protein expression of PLGF in CFs.Mean±SD.n=4. * P ＜0.05 vs control.圖2 Ang II 對(duì)PLGF 蛋白表達(dá)的影響

2 PLGF 對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的影響

運(yùn)用不同濃度(10、50 和100 ng/L)PLGF 干預(yù)成纖維細(xì)胞24 h 后細(xì)胞增殖如圖3 所示，100 ng/L PLGF 明顯誘導(dǎo)細(xì)胞增殖達(dá)2.21 倍(P ＜0.05)。PLGF(100 ng/L)干預(yù)細(xì)胞24 h 后，免疫熒光檢測(cè)α-SMA，結(jié)果如圖4 所示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加。相同濃度的PLGF 分別干預(yù)36 h 和48 h 后檢測(cè)α-SMA 蛋白水平表達(dá)，如圖5 所示，PLGF 干預(yù)48 h 后誘導(dǎo)α-SMA 表達(dá)明顯增加(P ＜0.05)。以上結(jié)果提示，PLGF可以誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。PLGF 干預(yù)細(xì)胞0 min、5 min、15 min、30 min 和60 min 后，檢測(cè)p-ERK1/2 蛋白水平表達(dá)，如圖6 所示，60 min 時(shí)p-ERK1/2 蛋白水平明顯高于對(duì)照組(P ＜0.01)。

Figure 3. The proliferation of CFs treated with PLGF. Mean ±SD.n=5. ＊＊P ＜0.01 vs control (0 ng/L).圖3 PLGF 對(duì)CFs 增殖的影響

Figure 4. Effect of PLGF on α-SMA protein expression detected by immunofluorescence (×200).Bar:5 μm.圖4 免疫熒光評(píng)價(jià)PLGF 對(duì)α-SMA 蛋白表達(dá)的影響

Figure 5. Effect of PLGF on α-SMA protein expression detected by Western blotting. 36C:36 h in control group;36P:36 h in PLGF group;48C:48 h in control group;48P:48 h in PLGF group.Mean ±SD. n =5.#P ＜0.05 vs 48C.圖5 PLGF 對(duì)α-SMA 蛋白表達(dá)的影響

3 Anti-PLGF 對(duì)Ang II 誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響

用不同濃度(5、10、20 和30 μg/L)PLGF 抗體(anti-PLGF)干預(yù)成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示濃度為20 μg/L 的anti-PLGF 抑制作用最明顯，干預(yù)24 h 后，結(jié)果如圖7 所示，Ang II 可以誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖達(dá)2.23倍(P ＜0.05)，Ang II 和anti-PLGF 聯(lián)用后可明顯抑制Ang II 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(P ＜0.05)。上述結(jié)果提示anti-PLGF 可拮抗Ang II 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖效應(yīng)。

4 Anti-PLGF 對(duì)Ang II 誘導(dǎo)α-SMA 表達(dá)影響

為探討anti-PLGF(20 μg/L)對(duì)拮抗Ang II 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響，以Ang II 及anti-PLGF 同時(shí)干預(yù)成纖維細(xì)胞48 h，結(jié)果如圖8 所示。Ang II 可增加α-SMA 的表達(dá)1.93 倍(P ＜0.05)，anti-PLGF 可 拮抗AngII 誘 導(dǎo) 的α-SMA 表達(dá)(P ＜0.05)。結(jié)果提示anti-PLGF 可拮抗Ang II 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。

Figure 6. Effect of PLGF (100 μg/L)on the protein expression of p-ERK1/2 and ERK1/2 detected by Western blotting.Mean±SD.n=5. ##P ＜0.01 vs control (0 min).圖6 PLGF 對(duì)p-ERK1/2 表達(dá)的影響

Figure 7. Effects of anti-PLGF and Ang II on the proliferation of CFs.Mean ± SD. n =5. * P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs Ang II.圖7 Anti-PLGF 對(duì)Ang II 誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的影響

Figure 8. Effects of anti-PLGF on Ang II-induced α-SMA protein expression. Mean ± SD. n = 5. # P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs Ang II.圖8 Anti-PLGF 對(duì)Ang II 誘導(dǎo)α-SMA 蛋白表達(dá)的影響

5 Anti-PLGF 對(duì)Ang II 誘導(dǎo)I 型和III 型膠原蛋白mRNA 表達(dá)的影響

Anti-PLGF(20 μg/L)和Ang II 共同干預(yù)SD 大鼠的心臟成纖維細(xì)胞30 h，結(jié)果如圖9 所示。Ang II可增加I 型和III 型膠原蛋白的mRNA 表達(dá)分別為2.33 倍和2.47 倍(均P ＜0.05)。Anti-PLGF 可拮抗Ang II 誘導(dǎo)I 型和III 型膠原蛋白mRNA 表達(dá)上調(diào)(P ＜0.05)。

Figure 9. Collagen I and collagen III mRNA expression in various groups.Mean±SD.n=5. * P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs Ang II.圖9 Anti-PLGF 對(duì)Ang II 誘導(dǎo)膠原蛋白mRNA 表達(dá)的影響

討 論

本研究通過(guò)觀察Ang II 對(duì)心臟成纖維細(xì)胞PLGF 表達(dá)的影響及后者對(duì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖和纖維化促進(jìn)作用，以及給予anti-PLGF 阻斷PLGF 后對(duì)Ang II 介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞激活的抑制效應(yīng)，探討PLGF 參與Ang II 介導(dǎo)的心肌重構(gòu)的可能機(jī)制。主要發(fā)現(xiàn):(1)PLGF 可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)化，激活ERK1/2;(2)Ang II 可通過(guò)AT1受體誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞PLGF 表達(dá)升高;(3)anti-PLGF 對(duì)Ang II 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖、表型轉(zhuǎn)化及I 型和III 型膠原蛋白基因表達(dá)效應(yīng)具有拮抗作用。

PLGF 是VEGF 家族成員之一，其堿基序列與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有高度的同源性。有研究表明，PLGF 在炎癥反應(yīng)和心肌重構(gòu)等病理過(guò)程中可能具有重要作用。在主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)心臟負(fù)荷增加的小鼠模型中，心肌細(xì)胞內(nèi)PLGF 的表達(dá)升高［5］，同時(shí)PLGF 在心臟超負(fù)荷狀態(tài)下，是腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)激活和巨噬細(xì)胞聚集的必需因子［6］。既往已有研究提示Ang II 可誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)上調(diào)，同時(shí)激活血管炎癥反應(yīng)［7］，并通過(guò)AT1受體調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生及一些疾病的病理過(guò)程如高血壓、心臟的肥大及心臟纖維化等［1］。但有關(guān)PLGF在上述病理過(guò)程中的作用研究尚少，本研究結(jié)果提示，Ang II 可能通過(guò)AT1受體后水平，上調(diào)PLGF 在細(xì)胞中的表達(dá)，參與Ang II 介導(dǎo)的心血管疾病的病理過(guò)程。

PLGF 參與心血管重構(gòu)的機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，PLGF 可能通過(guò)破壞基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3/腫瘤壞死因子α 轉(zhuǎn)化酶軸的平衡等多種途徑激活心臟的炎癥反應(yīng)，誘發(fā)或促進(jìn)心肌重構(gòu)［6，8］。本研究中，以PLGF 干預(yù)成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞增殖明顯，且成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化;同時(shí)短期給予PLGF 處理后，纖維化通路中的磷酸化ERK1/2 蛋白表達(dá)水平增高，而總ERK1/2 的表達(dá)水平無(wú)明顯改變，提示PLGF 可能通過(guò)影響細(xì)胞ERK1/2 蛋白的磷酸化水平產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。既往研究證實(shí)，磷酸化ERK1/2 水平增高后，可啟動(dòng)核內(nèi)纖維化、增殖性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，并成為心臟成纖維細(xì)胞趨化和增殖、膠原蛋白合成增加、心肌纖維化改變等效應(yīng)的共同通路之一［9-10］。

細(xì)胞的炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)或加重心肌纖維化過(guò)程［11-12］，大量研究證實(shí)，PLGF 可激活機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞，促使白細(xì)胞介素6、TNF-α 和單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)表達(dá)升高，抑制其活性后可通過(guò)減少炎癥反應(yīng)，阻斷疾病的進(jìn)展［13-15］。

值得注意的是，盡管給予PLGF 干預(yù)細(xì)胞后，PLGF 本身對(duì)TGF-β、I 型和III 型膠原蛋白的mRNA 表達(dá)水平無(wú)顯著影響，但用anti-PLGF 阻斷PLGF 后可拮抗Ang II 誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和α-SMA 蛋白水平表達(dá)增加，同時(shí)降低Ang II 誘導(dǎo)I 型和III 型膠原蛋白mRNA 表達(dá)水平。最近，Van Steenkiste 等［16］關(guān)于肝纖維化的研究亦表明，PLGF 雖不能直接引起纖維化指標(biāo)的顯著改變，但抑制PLGF 活性可顯著減少肝硬化小鼠肝纖維化及炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度。另一項(xiàng)有關(guān)肝纖維化的研究顯示，anti-PLGF 干預(yù)或PLGF 基因敲除同樣可拮抗二乙基亞硝胺或四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化［17］。以上2 項(xiàng)在肝細(xì)胞中觀察到的現(xiàn)象與本研究在心肌成纖維細(xì)胞中所觀察的結(jié)果近似。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的具體機(jī)制仍不清楚。有作者推測(cè)，在心臟處于超負(fù)荷狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)PLGF 與其受體Flt-1 可能通過(guò)激活心臟的炎癥反應(yīng)，使心肌纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的ERK 或Akt 活性增加，最終導(dǎo)致心肌纖維化，這一效應(yīng)可能需要病理狀態(tài)下其它周?chē)h(huán)境因素的協(xié)同作用［8］。我們推測(cè)Ang II 促細(xì)胞增殖及纖維化效應(yīng)，可能部分需通過(guò)誘導(dǎo)PLGF 在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，這一過(guò)程發(fā)生于AT1 受體后水平。anti-PLGF 通過(guò)與PLGF 結(jié)合，抑制高濃度PLGF 對(duì)ERK1/2 的磷酸化效應(yīng)，拮抗Ang II 的部分生物學(xué)效應(yīng)。

綜上所述，本研究提示Ang II 促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)PLGF 表達(dá)，PLGF 可能為Ang II 下游調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)ERK 途徑誘導(dǎo)細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化，anti-PLGF 可拮抗Ang II 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、表型轉(zhuǎn)化及I型和III 型膠原蛋白mRNA 的上調(diào)。PLGF 參與了Ang II 誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)過(guò)程。

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