王 琛, 劉 蜜, 孫 勝, 宋丹丹, 劉秀華△, 史大卓△

(解放軍總醫(yī)院 1中醫(yī)科, 3病理生理研究室, 北京 100853； 2中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院, 北京100091)

西洋參莖葉總皂苷通過抑制過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷*

王 琛1,2, 劉 蜜2, 孫 勝3, 宋丹丹3, 劉秀華3△, 史大卓2△

(解放軍總醫(yī)院1中醫(yī)科,3病理生理研究室, 北京 100853；2中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院, 北京100091)

目的觀察西洋參莖葉總皂苷(PQS)對大鼠心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷的保護作用，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)的角度探討其可能的分子機制。方法采用SD大鼠心肌I/R模型，隨機分為正常對照組、模型組與藥物預處理組，檢測血流動力學及血清心肌肌鈣蛋白T(cTnT)含量，以氯化三苯基四氮唑(TTC)和伊文思藍雙染法檢測心梗面積，采用HE染色和TUNEL法分別評估心肌病理損傷和心肌細胞凋亡程度，Western blotting法檢測心肌組織凋亡調(diào)節(jié)因子以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的表達。結果與I/R組相比，PQS+I/R組平均動脈壓降低32.0%(P<0.05)，左室±dp/dtmax分別升高64.0%和35.0%(P<0.05)，血清cTnT含量降低53.3%(P<0.05)，壞死面積/缺血面積(AN/AAR)百分比降低65.5%(P<0.05)，心肌細胞凋亡率降低54.9%(P<0.05)；心肌組織病理損傷程度減輕；抗凋亡蛋白Bcl-2表達升高110.0%(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達降低47.8%(P<0.05),鈣網(wǎng)蛋白(CRT)表達降低43.4%(P<0.05)，C/EBP同源蛋白(CHOP)和剪切后的caspase-12蛋白表達分別降低38.6%和23.7%(P<0.05)。結論PQS可顯著減輕大鼠心肌I/R損傷，其機制與降低I/R誘導的CRT過表達，抑制CHOP、caspase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路激活，從而抑制過度ERS介導的細胞凋亡有關。

西洋參莖葉總皂苷； 缺血/再灌注； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

西洋參莖葉總皂苷(Panaxquinquefoliumsaponins, PQS) 是西洋參莖葉中主要的活性成分。以往實驗研究表明，PQS具有減輕缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)誘導的心肌細胞凋亡和心律失常、改善梗死后心室重構等作用[1-3]，其機制可能與增強抗氧化酶活性、維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)等有關[4]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (endoplasmic reticulum, ER) 是細胞加工蛋白質(zhì)和貯存Ca2+的主要場所。缺血缺氧、葡萄糖/營養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭、大量自由基產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等均可引起ER功能障礙，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 (endoplasmic reticulum stress, ERS),表現(xiàn)為ERS標志分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78, GRP78)和鈣網(wǎng)蛋白 (calreticulin, CRT) 的表達。持續(xù)而嚴重的ERS可誘導ERS相關細胞凋亡途徑如CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白 (CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP) 和caspase-12的激活,加重I/R損傷[5-6]。我們前期研究表明PQS可通過抑制ERS相關細胞凋亡而減輕離體培養(yǎng)乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷[7]。PQS對大鼠心肌缺血/再灌注模型是否具有相同的作用，其機制是否與抑制過度ERS有關，尚缺少研究。因此本研究旨在證明PQS是否通過抑制過度ERS而減輕大鼠心肌I/R損傷。

材 料 和 方 法

1藥品和試劑

PQS粉由吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司提供；TUNEL試劑盒購自Promaga；氯化三苯基四氮唑 (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)和伊文思藍均購自Sigma；蛋白電泳分子量為7～175 kD，為Bio-Rad產(chǎn)品；兔抗人CRT、caspase-12和GRP78多克隆抗體均購自Stressgen；兔抗人GAPDH單克隆抗體、小鼠抗人CHOP單克隆抗體、兔抗人Bax和Bcl-2多克隆抗體均購自Cell Signal；增強化學發(fā)光 (ECL) 試劑盒購自Millipore；辣根過氧化酶標記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG均購自Santa Cruz。

2動物模型建立

清潔級健康SD大鼠，雌雄各半，體重(150±20)g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心[許可證號為SCXK-(軍)2007-004]，適應性喂養(yǎng)1周。術前禁食12 h，自由飲水，以2%戊巴比妥鈉 (2.3 mL/kg) 腹腔注射麻醉后固定于鼠臺，氣管插管，采用微型動物呼吸機(浙江大學醫(yī)療器械廠生產(chǎn)) 支持呼吸，頻率50～60 min-1，潮氣量4～6 mL。連接SMUP-PC1型生物信號處理系統(tǒng)，以MFL Lab200心電軟件(復旦大學醫(yī)學院生理教研室研制)記錄標準導聯(lián)心電圖。按照既往報道方法[8]復制心肌I/R模型：胸骨正中切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，在胸骨左緣3、4 肋間開胸暴露心臟。打開心包膜，揭開脂肪墊，暴露左心耳后，持7號針線，在肺動脈圓錐和左心耳之間冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary, LAD) 處穿一縫合線，將充水(0.5 mL) 的球囊墊于血管與結扎線之間，結扎造成心肌缺血。心電圖監(jiān)測顯示進行性心肌缺血變化后證明造模成功，45 min后，抽出球囊，關胸，再灌注24 h。結束實驗時，動脈取血，用于血清肌鈣蛋白(cardiac troponin,cTnT)測定，按照不同檢測指標分別留取心肌組織標本迅速液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫糜谥苽浣M織切片或進行心肌梗死面積測定。

3實驗分組

隨機分為3組，每組15只。(1)假手術 (sham) 組：與藥物組等量飲用水灌胃，每天1次，連續(xù)6周，開胸后穿線，但不結扎冠狀動脈左前降支；(2)I/R組：與藥物組等量飲用水灌胃，每天1次，連續(xù)6周，開胸后可逆性結扎冠狀動脈左前降支致心肌缺血45 min，再灌注24 h；(3)藥物預處理(PQS+I/R)組：(根據(jù)預實驗結果)270 mg·kg-1·d-1PQS水溶液灌胃，每天1次，連續(xù)6周后進行與I/R組相同的干預。

4觀察指標

4.1心率(heart rate,HR)、平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)和左室壓上升、下降最大速率(±dp/dtmax)測定 實驗結束時，大鼠稱重，2%戊巴比妥腹腔麻醉，固定后分離右側頸總動脈，將PE-50 導管插入頸總動脈經(jīng)壓力傳感器與SMUP-PC1型生物信號處理系統(tǒng)相連。穩(wěn)定10 min后，描計頸動脈波形,再將導管送入左室，描計左心室壓力曲線。以MFL Lab200心功能軟件記錄HR、MAP和±dp/dtmax。

4.2血清cTnT含量測定 經(jīng)動脈插管抽取血液約5 mL，肝素抗凝，1 000 r/min離心10 min，收集血清，液氮速凍，-80 ℃保存。以全自動生化分析儀(日立公司)測定血清心肌損傷標志物cTnT的含量。

4.3心梗面積測定 按照文獻[9]報道方法，實驗結束后原位結扎左冠狀動脈前降支，經(jīng)主動脈逆行灌注1%伊文思藍2 mL，將非缺血區(qū)藍染，顯示出缺血區(qū)心肌。取出心臟，去除左右心房，置于-20 ℃冷凍20 min，垂直其長軸橫切為5片厚約2 mm的心肌片，按順序置人2% TTC磷酸緩沖液中，避光37 ℃孵育10 min，此時梗死區(qū)為灰白色，即壞死面積(area of necrosis，AN)；缺血非梗死區(qū)呈磚紅色，缺血區(qū)面積(area at risk，AAR)為灰白區(qū)與磚紅色區(qū)之和，正常區(qū)為藍色。掃描儀掃描成像，以Image-Pro Plus圖像分析軟件(Version 4．1) 分別計算各部分面積，缺血心肌用AAR與左心室(left ventricle，LV)面積之比表示，梗死范圍以AN與AAR之比表示。

4.4心肌細胞凋亡測定 經(jīng)頸動脈取血后，取出心臟，將缺血區(qū)心肌組織(左心室前壁中間段)剪下，4%甲醛固定1周，常規(guī)石蠟包埋，制備3 μm切片。采用TUNEL法，按照試劑盒說明進行心肌組織切片細胞凋亡的原位檢測。共聚焦顯微鏡觀察，正常心肌細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈深淺不一的綠色。每張切片于凋亡細胞分布區(qū)域隨機取5個高倍視野，計算平均每個視野中的凋亡細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比(%)，以凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)表示。

4.5心肌病理學觀察 采用HE染色，將心肌組織樣本固定于4% 甲醛1周后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度3 μm，脫蠟至水，Harris蘇木素染核，70%鹽酸乙醇分化，1%乙醇伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡觀察并攝像。

4.6Western blotting分析 按文獻報道方法[10]，提取心肌組織總蛋白，Bradford法蛋白定量后，-80 ℃保存。取上述蛋白提取液上清 (含蛋白150 μg) 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE，12%分離膠)。將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素 (nitrocellulose, NC)膜。5% BSA封閉40 min后分別加入Bcl-2、Bax、CRT、GRP78和caspase-12多克隆抗體(均為1∶500)和CHOP單克隆抗體 (1∶500) 4 ℃過夜孵育，1× TBS-T洗膜后，以相應的II抗孵育1.5 h，并以GAPDH (1∶500) 單克隆抗體重復上述實驗過程，作為上樣對照?；瘜W發(fā)光ECL顯示，采用Image-Pro Plus (Version 4.1) 軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值 (integrated absorbance，IA=A×面積)，以靶蛋白IA值/GAPDHIA值的比值反映靶蛋白水平。

5統(tǒng)計學處理

采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(mean±SD) 表示，采用單因素方差分析 (One-way ANOVA) 進行多組間比較，采用q檢驗進行多組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1PQS對大鼠心肌I/R損傷的影響

1.1平均動脈壓和左室壓上升、下降最大速率 術中假手術組大鼠狀態(tài)良好，I/R組和PQS+I/R組分別死亡大鼠3只和4只，死亡原因包括感染、嚴重心律失?；蚵樽碇滤?。各組大鼠心率無顯著差異 (P>0.05)；與sham組比較，I/R組MAP 高55% (P<0.05)，左室(±dp/dtmax)分別低42%和43% (P<0.05)。PQS干預后可明顯改善I/R大鼠心功能，表現(xiàn)為PQS+I/R組MAP較I/R組低32% (P<0.05)，±dp/dtmax分別較I/R組高64%和35% (P<0.05),見表1。

表1 PQS對大鼠血流動力學的影響

I/R: ischemia/reperfusion; PQS:Panaxquinquefoliumsaponins.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

1.2PQS對血清cTnT含量的影響 I/R組血清cTnT含量較sham組顯著升高，為sham組的3.9倍(P<0.05)，PQS干預可明顯減少I/R大鼠血清cTnT的含量，PQS+I/R組血清cTnT含量較I/R組低53.3% (P<0.05),見圖1。

1.3PQS對大鼠心肌梗死面積的影響 伊文思藍和TTC雙染評價心梗面積，結果顯示,sham組大鼠無心肌梗死，sham組、I/R組和PQS+I/R組的缺血區(qū)面積分別為(49.8 ±3.4)%、(50.2±2.2)% 和(50.1±1.3)%，各組間無顯著差異(P>0.05)；I/R組AN/AAR百分比為(44.2±1.4)%，PQS明顯縮小心梗面積，PQS+I/R組AN/AAR百分比為(15.3±4.2)%，較I/R組降低65.5%(P<0.05),見圖2。

Figure 1. Effect of PQS on content of cTnT in serum.Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

圖1PQS對血清cTnT含量的影響

Figure 2. Effect of PQS on myocardial infarct size in rats.I/R: ischemia/reperfusion; PQS:Panaxquinqueliumsaponins.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsI/R.

圖2PQS對心肌梗死面積的影響

1.4PQS對心肌細胞凋亡的影響 Sham組心肌細胞凋亡指數(shù)為(8.2±0.6)%，I/R可致心肌細胞凋亡顯著增加，I/R組心肌細胞凋亡指數(shù)為(56.9±6.0)%，是sham組的7.0倍(P<0.05)，PQS可顯著減輕I/R所致的心肌細胞凋亡，PQS+I/R組心肌細胞凋亡指數(shù)為(25.7±5.1)%，較I/R組低54.9% (P<0.05),見圖3。

1.5心肌組織病理形態(tài)學改變 光鏡檢查結果顯示，sham組心肌組織形態(tài)學無明顯改變，肌纖維完整，排列規(guī)則；I/R組心肌纖維排列不規(guī)則，結構紊亂，局部橫紋消失，呈斷裂、壞死融合；PQS+I/R組病理變化程度較I/R組減輕，未見明顯的心肌纖維斷裂、溶解、壞死,見圖4。

1.6凋亡相關因子Bcl-2、Bax蛋白的表達 結果顯示,與sham組比較，I/R組Bcl-2蛋白表達低54.9%(P<0.05)，Bax蛋白表達是sham組的3.9倍(P<0.05)。PQS可顯著誘導抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，PQS+I/R組Bcl-2蛋白表達是I/R組的2.1倍 (P<0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax的表達，Bax蛋白表達較I/R組低47.8% (P<0.05),見圖5。

2PQS對I/R心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關分子蛋白表達的影響

2.1GRP78和CRT蛋白的表達 結果顯示,I/R可明顯誘導GRP78和CRT蛋白的表達，與sham組比較，I/R組GRP78、CRT蛋白表達水平顯著增加，分別為sham組的3.1倍和3.0倍(P<0.05)；PQS可抑制I/R誘導的CRT過表達，較I/R組低43.4% (P<0.05),見圖6。

2.2CHOP蛋白表達的變化和caspase-12的活化 I/R可明顯誘導CHOP蛋白表達，為sham組的3.4倍(P<0.05)。PQS抑制I/R誘導的CHOP 蛋白表達，較I/R組降低38.6% (P<0.05),見圖7。

采用可同時識別caspase-12酶原 (pro-caspase-12，分子量約48～50 kD) 和剪切后的caspase-12 (cleaved caspase-12，分子量為36 kD) 的特異性抗體，進行免疫印跡檢測，結果顯示,I/R可明顯誘導caspase-12蛋白剪切活化，剪切后的caspase-12的蛋白表達是sham組的2.5倍(P<0.05)；PQS抑制I/R后caspase-12 蛋白活化，PQS+I/R組剪切后caspase-12蛋白表達較I/R組降低23.7% (P<0.05),見圖7。

討 論

冠脈結扎法建立大鼠心肌I/R損傷模型，為目前評價藥物心肌缺血保護最常用的模型之一。因?qū)嶒灤笫笃废导冋?、組間差異小、冠脈側枝循環(huán)少、易結扎、操作簡單等特點，成為首選I/R動物模型。本研究采用SD大鼠， 建立I/R損傷模型，肉眼觀察可見模型組左室前壁心肌顏色變淡甚至蒼白，而假手術組無明顯改變。心肌組織病理學染色與心梗面積測定既是反映組織損傷最直觀的指標，亦是反映藥物治療缺血性損傷有效性的客觀證據(jù)。本實驗采用心肌組織病理HE染色觀察心肌組織病理變化，結果顯示模型組細胞核固縮，間質(zhì)水腫，心肌纖維排列紊亂、斷裂；假手術組未見明顯改變； PQS組心肌組織病理變化程度較I/R組減輕。采用伊文思藍、TTC雙染評價心梗面積，結果顯示各組缺血區(qū)無顯著差異，說明各組結扎部位一致，不存在因結扎部位的不同而造成的人為誤差；模型組心梗面積較假手術組明顯增加，PQS可顯著減少I/R導致的心梗面積；平均動脈壓是一個心動周期中持續(xù)地推動血液向前流動的平均推動力，更精確地反映心臟和血管的機能狀態(tài)，每一心動周期由于舒張期時程長于收縮期，故平均動脈壓不是收縮壓與舒張壓的平均數(shù)，而是更靠近于舒張壓，平均動脈壓升高說明血管壁彈性減少，順應性下降。本研究發(fā)現(xiàn)模型組平均動脈壓較假手術組明顯升高，反映左室舒張及收縮功能的±dp/dtmax顯著降低， PQS能顯著降低I/R引起的平均動脈壓升高，增加左室±dp/dtmax；心肌損傷標志物cTnT是目前診斷心肌損傷的特異性標志物，心肌急性缺血(氧)時，細胞膜損傷，通透性增加，cTnT大量漏出。本研究發(fā)現(xiàn)缺血45 min、再灌注24 h后，血清cTnT含量明顯增加。與模型組相比，PQS組血清nTnT顯著減少。以上均提示PQS可保護I/R心肌損傷，表現(xiàn)為減輕心肌壞死、改善心功能、減輕心肌細胞膜損傷等。

Figure 3. Effect of PQS on cardiomyocyte apoptotic index.Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

圖3PQS對大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的影響

Figure 4. Morphological changes of rat myocardial tissues (×200). A:sham group; B:ischemia/reperfusion group; C: pretreatment withPanaxquinqueliumsaponins group.

圖4大鼠心肌組織病理形態(tài)學改變

Figure 5.Panaxquinquefoliumsaponins (PQS) reduced the expression of pro-apoptotic protein Bax and increased expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 in I/R myocardium.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R.

圖5PQS對I/R心肌Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

Figure 6. Effect ofPanaxquinquefoliumsaponins (PQS) on the expression of GRP78 and CRT in I/R myocardium.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R.

圖6PQS對I/R心肌GRP78和CRT蛋白表達的影響

Figure 7. Effect ofPanaxquinquefoliumsaponins (PQS) on the expression of the ERS-associated apoptotic protein CHOP and activation of the apoptotic effector enzyme caspase-12 in I/R myocardium.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R.

圖7PQS對I/R心肌CHOP蛋白表達及caspase-12活化的影響

細胞凋亡是心肌I/R損傷的一個重要特征，在心肌I/R損傷過程中發(fā)揮重要作用[11]。Gottlieb等[12]利用家兔離體心臟灌流模型首次發(fā)現(xiàn)I/R中存在心肌細胞凋亡。Musat-Marcu等[13]研究發(fā)現(xiàn)離體灌流大鼠心臟再灌注早期即可發(fā)生心肌細胞凋亡。TUNEL法測心肌細胞凋亡，既可定性又可定量，可準確定位，且靈敏度高。本研究利用此方法發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，模型組心肌細胞凋亡指數(shù)顯著增加，PQS可顯著降低I/R引起的細胞凋亡，提示PQS可通過抑制I/R心肌細胞凋亡，減輕心肌I/R損傷。抗凋亡基因bcl-2與促凋亡基因bax參與心肌I/R損傷細胞凋亡的調(diào)控[14-16]，抑制細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，是促進心肌I/R損傷后心功能恢復和減輕心肌致死性損傷的一條重要途徑。本研究采用Western blotting，檢測凋亡相關因子Bcl-2和Bax的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)模型組促凋亡因子Bax蛋白表達較假手術組顯著升高，抗凋亡因子Bcl-2的表達明顯降低，PQS可明顯降低I/R誘導的Bax蛋白表達，升高Bcl-2蛋白表達。提示PQS可通過調(diào)節(jié)凋亡相關因子的表達，調(diào)控心肌細胞凋亡過程，減輕心肌損傷。

I/R發(fā)生的主要病理環(huán)節(jié)是氧自由基產(chǎn)生和鈣超載。ER是調(diào)節(jié)Ca2+和蛋白質(zhì)合成的重要場所，ER理化環(huán)境改變和ER過負荷等因素導致的ERS在I/R損傷的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義[17]。GRP78為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志分子，早期ERS時GRP78與ER內(nèi)誤折疊及未折疊蛋白結合，減輕ER負荷，恢復其穩(wěn)態(tài)。因此，GRP78的表達標志ERS的發(fā)生。Shibata等[18]發(fā)現(xiàn)，小鼠大腦缺血1 h后GRP78表達升高；Flores-Diaz等[19]報道，心肌缺血/缺氧可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78、CRT表達上調(diào)。本研究采用Western blotting方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)各處理組GRP78的蛋白表達均明顯高于假手術組，提示I/R誘發(fā)了ERS，與文獻[20]報道一致。PQS通過調(diào)節(jié)ERS，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)從而增加心肌抗I/R損傷的能力；CRT是ER中主要鈣結合伴侶蛋白，在維持細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)，協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊及調(diào)節(jié)細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。Ihara等[21]利用H9c2成心肌細胞研究證實高表達的CRT可促進細胞凋亡。本研究亦發(fā)現(xiàn)I/R誘導CRT蛋白表達水平顯著升高，與文獻報道一致[22]。PQS可減輕I/R誘導的CRT過表達，表明PQS可通過調(diào)節(jié)CRT蛋白表達，減少I/R引起的細胞凋亡。

I/R誘導細胞凋亡，除經(jīng)典的死亡受體途徑和線粒體途徑外，ERS相關凋亡途徑引起廣泛關注[23-26]。持續(xù)或嚴重的ERS通過激活凋亡信號分子 CHOP、caspase-12和JNK啟動ERS相關凋亡途徑，誘導細胞凋亡。CHOP又稱生長停滯及DNA損傷誘導蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153, GADD153)，是CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，為ERS相關凋亡途徑的特異性標志物。嚴重ERS時，CHOP通過直接調(diào)節(jié)核內(nèi)靶基因，增加細胞對ERS介導凋亡的敏感性[27]。研究表明，缺血/缺氧可誘導CHOP表達顯著增加，破壞了Bcl-2家族促凋亡與抗凋亡基因之間的平衡，促進細胞凋亡[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，I/R顯著誘導了CHOP蛋白表達，PQS可顯著抑制I/R誘導的CHOP蛋白表達，提示PQS可能通過抑制過度ERS介導的細胞凋亡起到心肌保護作用。Caspase-12定位于ER外膜，以無活性的酶原形式存在，是ERS相關凋亡途徑的特異性分子，持續(xù)或嚴重的ERS引起caspase-12激活，活化的caspase-12進一步激活casepase-9，接著激活caspase-3，最終導致細胞凋亡[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R可明顯誘導剪切后caspase-12的蛋白表達，提示ERS相關凋亡途徑在I/R損傷中具有重要作用，與文獻[22]報道一致。PQS可顯著抑制I/R誘導的caspase-12活化， PQS抑制I/R引起的細胞凋亡也與其抑制caspase-12活化有關。

綜上所述，PQS具有抗大鼠心肌I/R損傷的作用，其機制可能通過抑制過度ERS引起的細胞凋亡有關，表現(xiàn)為降低I/R誘導的CRT過表達，抑制CHOP、caspase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡通路激活，其下游信號通路有待進一步探索。

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Panaxquinquefoliumsaponinsprotectratmyocardiumfromischemia/reperfusioninjurythroughattenuatingexcessiveendoplasmicreticulumstress

WANG Chen1,2, LIU Mi2, SUN Sheng3, SONG Dan-dan3, LIU Xiu-hua3, SHI Da-zhuo2

(1DepartmentofTraditionalChineseMedicine,3DepartmentofPathophysiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China;2XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China.E-mail:xiuhualiu98@yahoo.com.cn;shidz666@sohu.com)

AIM: To investigate whether excessive endoplasmic reticulum stress (ERS) is involved in the protective mechanism ofPanaxquinquefoliumsaponins (PQS) against ischemia/reperfusion (I/R) injury in rat myocardium.METHODSThe model of myocardial I/R injuryinvivowas made by ligating the left anterior descending artery for 45 min followed by 24 h of reperfusion in SD rats. The hemodynamics and serum content of cardiac troponin T (cTnT) were measured. The myocardial infarct size was measured by Evans blue and 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining. Cardiomyocyte apoptosis was detected usinginsituTDT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The protein levels of glucose-regulated protein 78 (GRP78), calreticulin (CRT), C/EBP homologous protein (CHOP), caspase-12, apoptosis-associated proteins Bax and Bcl-2 were determined by Western blotting.RESULTSCompared with I/R group, the mean arterial pressure in PQR+IR group was decreased by 32.0%, and left ventricular±dp/dtmaxwas increased by 64.0% and 35.0%， respectively.The serum content of cTnT was decreased by 53.3%, the percentage of area of necrosis (AN)/area at risk (AAR) was reduced by 65.5% and the apoptosis rate was decreased by 54.9%.The myocardial pathological changes were improved. Bcl-2 protein expression was increased by 110.0% and that of Bax was decreased by 47.8%. CRT protein expression was decreased by 43.4 %, CHOP protein expression and the protein level of cleaved caspase-12 were decreased by 38.6% and 23.7% in PQS+I/R group.CONCLUSIONPQS alleviates I/R injury in myocardium by inhibition of excessive ERS.

Panaxquinquefoliumsaponins; Ischemia/reperfusion; Endoplasmic reticulum stress

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.004

1000- 4718(2013)01- 0020- 08

2012- 08- 20

2012- 11- 21

科學技術部國際科技合作項目資助課題(No.2010DFA31690)

△通訊作者 劉秀華 Tel：010-66939774； E-mail: xiuhualiu98@yahoo.com.cn； 史大卓 Tel： 010-62860499； E-mail: shidz666@sohu.com